狼毒大戟三萜的提取纯化、鉴定与抑瘤抑菌等作用研究

摘要

恶性肿瘤是严重威胁人类生命健康的重大疾病，也是目前医学上最难医治的顽症之一。寻求彻底治疗癌症的手段与药物已成为人们的迫切需要，科学界也将寻找具有新靶点的抗肿瘤药物作为研究的热点之一。天然资源的生物多样性和天然化合物的结构多样性为发掘抑癌新药提供了广泛的机遇。中药是祖国医学的重要组成部分，研究发现中草药在抑制或杀伤肿瘤细胞方面，还是患者改善症状和减轻放化疗的不良反应等方面均发挥了不可低估的作用。然而，传统中药大都采用含数十种化合物的多味药材组成的复方进行治疗，这样复杂的药物体系给现代药理评价带来极大的挑战，也是中医药被认为“说不清、道不明”的一个主要原因;若能对单味中药，特别是起特异治疗效果的某单一组分进行研究，明确疗效与作用机制，不仅经济，疗效可靠，还可为设计更理想的新药提供新的化学结构，后者常为创制新药的先导化合物。本课题基于此思路对传统中药材狼毒大戟进行药用成分提取纯化、结构分析与及抑瘤、抑菌和清除自由基等方面的研究。
　　狼毒大戟(Euphorb ia fischeriana)是我国传统中药材，又名狼毒、猫眼睛，是大戟科大戟属多年生草本植物，主要生长于丘陵坡地以及林缘地带。植物中的三萜类物质已被证实具有抗菌消炎，抗肿瘤，抗病毒的作用。许多学者研究了狼毒大戟中的多种活性成分，但是对狼毒大戟三萜类物质的提取、分离以及生物活性等研究至今鲜有报道。本文对狼毒大戟三萜类物质进行了提取和初步分离，结合对其多方面的生物活性的考察，以期对其合理利用提供一些理论参考。研究的主要内容和结果如下:
　　1.利用超声波辅助法提取狼毒大戟根部总三萜物质，通过香草醛-硫酸法对其进行定量测定，同时进行方法学考察，根据单因素结果设计正交试验确定最佳工艺。结果表明:提取方法简单高效，可信度高。狼毒大戟总三萜的最佳提取工艺为乙醇体积分数为80％，料液比为1∶10，超声功率为70W，超声处理时间为60min，最高提取率为5.86％。
　　2.通过定性测定的颜色反应，结合红外、紫外光谱及化学预试等方法提取物进行成分分析，然后利用有机溶剂萃取对其进行组分化分离。结果表明提取物中可能含有鞣质、甾体、有机酸和黄酮类以及三萜类物质。石油醚层、乙酸乙酯层、正丁醇、萃余水层中三萜含量比例约为36∶6∶5∶12。
　　3.利用滤纸片法以及试管二倍稀释法研究不同萃取层对5种常见菌（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、绿脓杆菌）的抑菌效果;然后利用三种自由基清除模型（DPPH、羟基以及超氧阴离子自由基）确定各萃取层自由基清除能力。结果表明，除萃余水层外，其它各层对5种菌均有一定的抑制作用，各萃取层对自由基清除效果都比较好，其中乙酸乙酯层最好。
　　4.利用MTT法测定不同萃取层对食管癌EC109肿瘤细胞株、4T1小鼠乳腺癌细胞、U87人脑胶质质瘤细胞株、293T人胚肾瘤细胞株以及人肺癌A549肿瘤细胞等肿瘤细胞株的抑制作用;选取抑瘤效果最好的组分进行纯化以及红外、紫外光谱及液相色谱测定。结果表明，石油醚层和乙酸乙酯层的抑瘤效果较好，石油醚层最好，经鉴定其含有的有效成分为五环三萜类物质羽扇豆醇。

目录

摘要

第一章 绪论

1．1 狼毒大戟研究概述

1．1．1 狼毒大戟植物学形态特征及分布

1．1．2 狼毒大戟的主要化学成分

1．1．3 狼毒大戟的生化药理作用

1．2 三萜类化合物概述

1．2．1 萜类化合物的结构和命名

1．2．2 三萜化合物的结构和分布

1．2．3 三萜化合物的性质

1．2．4 三萜化合物的提取

1．2．5 三萜类化合物的分离纯化

1．2．6 三萜化合物的生物活性

1．3 本论文研究目的与意义

1．4 研究内容

1．5 课题创新点

第二章 狼毒大戟根部总三萜提取工艺优化

2．1 材料与仪器

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验试剂

2．1．3 实验设备

2．2 实验方法

2．2．1 狼毒大戟中总三萜类化合物的提取

2．2．2 总三萜类化合物的定量测定

2．2．3 方法学考查

2．2．4 超声波辅助提取三萜工艺

2．3 结果与讨论

2．3．1 齐墩果酸标准曲线绘制

2．3．2 狼毒大戟根部总三萜含量

2．3．3 狼毒大戟三萜含量测定的方法学考查

2．3．4 狼毒大戟三萜提取的单因素实验结果

2．3．5 超声辅助提取正交优化试验

2．4 本章小结

第三章 狼毒大戟提取物定性鉴定及组分化分离

3．1 材料与仪器

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验试剂

3．1．3 实验设备

3．2 实验方法

3．2．1 狼毒大戟根部化学物质的预试

3．2．2 狼毒大戟总三萜类提取液的光谱学解析

3．2．3 狼毒大戟根部总三萜提取液的组分化分离

3．3 结果与讨论

3．3．1 狼毒大戟根部化学成分的预试

3．3．2 狼毒大戟三萜提取物的光谱分析

3．3．3 狼毒大戟根部总三萜提取液的组分化分离

3．4 本章小结

第四章 狼毒大戟组分化提取物抑茵及抗氧化活性研究

4．1 材料和仪器

4．1．1 实验材料

4．1．2 实验试剂

4．1．3 实验设备

4．2 实验方法

4．2．1 样品试液的制备

4．2．2 狼毒大戟根部三萜组分化提取物抑菌性研究

4．2．3 狼毒大戟根部三萜组分化提取物的抗氧化性研究

4．3 结果与讨论

4．3．1 狼毒大戟根部组分化提取液抑菌性试验结果

4．3．2 狼毒大戟根部三萜组分化提取物自由基清除试验结果

4．4 本章小节

第五章 狼毒大戟三萜体外抗肿瘤研究及纯化鉴定

5．1 实验材料与设备

5．1．1 实验材料

5．1．2 实验试剂

5．1．3 实验设备

5．2 实验方法

5．2．1 组分化提取物体外抗肿瘤研究

5．2．2 三萜类化合物的纯化

5．2．3 抑瘤活性物质的确定

5．3 结果和讨论

5．3．1 狼毒大戟各萃取层体外抑瘤实验结果

5．3．2 抑瘤活性物质的鉴定

5．4 本章小结

结论

展望

参考文献

攻读学位期间的研究成果

声明

致谢