一种新型芋螺毒素TeA31的基因克隆及其人工合成

摘要

芋螺毒素（Conotoxin，CTX）是一类由热带海洋肉食性软体动物芋螺（Conus）分泌出来的，由8～41个氨基酸残基组成的小分子多肽，富含二硫键。芋螺毒素的化学结构新颖，生物活性强，作用靶位选择性高，已成为药理学和神经科学的有力工具和药物开发的新来源，是全世界海洋药物研究的热点之一。已经成功研究的芋螺毒素大多属于A—超家族，O—超家族和M—超家族等，如MVIIA，SO3等。而对T—超家族芋螺毒素的研究，则鲜见报道。T—超家族芋螺毒素作为芋螺毒素资源的一大成员，广泛存在于各种芋螺中，具有巨大的药物开发和研究潜力。 本研究从海南产的织锦芋螺（C．textile）毒管中提取总RNA后，再反转录为cDNA，以之为模板，利用RT—PCR法分离克隆到一个新型T—超家族芋螺毒素的cDNA，全长389bp，命名为TeA31N：该cDNA编码的毒素肽前体命名为TeA31P，已在GenBank中登录，序列号为DQ141136。根据TEA31 N的核苷酸序列，推测出其前体序列TeA31P由61氨基酸残基组成：MPCLPVFVILLLL IASVPSDAQL KTKDDMPLPSFNGN ARRTPRMLSNKRICCYPNVWCCD。该序列包括芋螺毒素前体典型的三个区域：长度为24个氨基酸的信号肽（上述序列中的灰色背景部分）；长度为26个氨基酸的前肽，以及长度为11个氨基酸的成熟肽。在前肽与成熟肽之间带有标准的蛋白酶水解位点（—XKR），据此推测出其成熟肽TeA31序列为：ICCYPNVWCCD（11AA）。 本实验用ABI公司433A型全自动多肽合成仪进行固相人工合成，并用Fmoc法成功合成了TeA31线性肽，经HPLC分离与质谱鉴定，TEA31的实际分子量为1317．42，与理论值1317．47相符。经质谱鉴定确证后的TeA31合成肽，再用HPLC进行分离纯化，获得的纯化TeA31肽在合适的条件下进行氧化折叠，折叠产物经HPLC纯化后用质谱鉴定分子量为1313．8，与氧化肽的理论分子量1313．47相符。至此，本研究从海南产织锦芋螺毒液中成功克隆到了一个新型T—超家族芋螺毒素TEA31的全长cDNA，及其人工合成肽，为后续的生物活性研究与结构鉴定提供了材料。同时，建立了一套较为完善的芋螺毒素基因克隆，人工合成与合成肽分离纯化和氧化折叠的实验技术与方法。可为新型海洋药物——海南产芋螺毒素的研究与开发提供基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

1 引言与文献综述

1.1 芋螺毒素的研究历史及概况

1.2芋螺毒素的分类

1.3芋螺毒素的分子生物学特性和药理学活性

1.3.1 芋螺毒素的分子生物学特性

1.3.2芋螺毒素的药理学活性

1.4 获得芋螺毒素的几种方法

1.4.1直接从芋螺中提取

1.4.2基因克隆获得

1.4.3 多肽固相人工合成

1.5 芋螺毒素的人工合成

1.5.1 多肽固相合成的原理

1.5.2线性肽的氧化折叠

1.5.3多肽合成法合成芋螺毒素的研究现状

1.6芋螺毒素的应用现状

1.6.1 作为多种离子通道、受体等的分子探针

1.6.2用于神经性疾病等的治疗

1.7 T-超家族芋螺毒素的研究现状

1.8 芋螺毒素的研究展望

2 本研究的目的和意义

3材料与方法

3.1 材料

3.1.1菌种与芋螺

3.1.2生化试剂

3.1.3仪器

3.2方法

3.2.1 织锦芋螺总RNA的提取

3.2.2 织锦芋螺总RNA浓度和纯度的检测

3.2.3 RNA反转录合成cDNA

3.2.4 RT—PCR

3.2.5 PCR产物的回收

3.2.6 感受态细胞的制备

3.2.7 PCR产物与T-easy载体的连接反应

3.2.8 连接产物的转化

3.2.9 重组质粒的小量提取

3.2.10重组质粒的酶切鉴定

3.2.11 重组质粒的测序与保存

3.2.12TeA31人工合成反应及裂解反应

3.2.13线性芋螺毒素肽的纯化

3.2.14合成线性肽分子量的测定

3.2.15线性芋螺毒素肽的再次纯化

3.2.16芋螺毒素TeA31的氧化折叠

3.2.17折叠后芋螺毒素的纯化

3.2.18氧化折叠后的TeA31的分子量检测

4结果与分析

4.1 织锦芋螺的分类地位及形态特征

4.2 TEA31P cDNA的PCR扩增及其克隆测序

4.3 TeA31P cDNA序列(TeA31N)分析

4.4TeA31N、TeA31P的同源性比较分析

4.5 TeA31的人工合成

4.6 TeA31线性肽的纯化

4.7 合成线性肽TeA31的分子量测定

4.8 TeA31线性肽的氧化折叠及其HPLC纯化

4.9氧化折叠后的TeA31之分子量测定

5 讨论

5.1关于TEA31的合成与纯化策略

5.2关于TeA31氧化折叠的有关问题

5.3关于T-CTX翻译后修饰的研究状况

5.4 TeA31的应用前景及后续研究工作

参考文献

附录

作者在读期间科研成果简介

后记