通过基因定点突变提高甲基对硫磷水解酶MPH的热稳定性

摘要

有机磷农药在广泛应用的同时也给环境带来了严重的污染,甚至威胁到人类的健康。早在上世纪六七十年代,就有人发现在自然环境中微生物可以分泌有机磷降解酶来降解有机磷农药,它可以破坏有机磷分子的磷酸酯键,最终使有机磷化合物毒性消失,这一发现为消除有机磷农药造成的污染提供了更好的途径。
　　本文研究的对象是一个来源于苍白杆菌(Ochrobactrum sp. M231)的甲基对硫磷水解酶MPH。MPH具有高效的降解甲基对硫磷的水解活性,但是其热稳定性却很差。同时,另一个来源于假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes C2-1)的甲基对硫磷水解酶OPHC2,和MPH具有相同的水解活性,但是热稳定性却比MPH好。为了提高甲基对硫磷水解酶MPH的热稳定性,将其和OPHC2进行比对分析,两者蛋白质序列的一致度和相似度分别为48％和66%。根据比对结果,选择了位于蛋白质相似度低的一段区域,通过单点突变和组合突变对其基因进行了分子设计,将突变酶在大肠杆菌中进行表达纯化,然后对其酶学性质进行分析以确定突变效果。
　　本研究共得到4个突变体,将突变酶和野生型酶进行热稳定性比较,经分子改良后的突变酶在热稳定性上有着不同程度的改变。其中突变体MPHP41D_P43K的热稳定性较野生型有了显著的提高,在65℃保温10min后仍然具有70%的酶活,在65℃和70℃条件时的半衰期分别是原酶的2倍和1.5倍,其中它的比活也是原酶的1.8倍。究其原因,可能是由于将蛋白表面的第41位和第43位的脯氨酸突变成两个分别带有相反电荷的氨基酸时,增强了蛋白表面的静电作用而造成的。另外三个突变体的热稳定性均没有提高。
　　本研究通过基因工程手段,定向改良了甲基对硫磷水解酶 MPH,使其热稳定性较野生型有了很大的提高,为该酶的广泛应用,以及提高酶热稳定性的研究奠定了很好的理论基础。

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第一部分 文章综述

1．有机磷农药的简介

2．有机磷降解酶的简介

3．有机磷降解酶分子与其酶活性的研究进展

4．热稳定性研究进展

5． 提高热稳定性的策略

6．问题与展望

7．研究的目的与意义

8．本实验技术路线图

第二部分 实验材料与方法

1．实验材料与仪器

2． 试验方法

第三部分 实验结果与分析

1．MPH的比对结果及突变位点的确定

2．甲基对硫磷水解酶MPH基因的克隆及原核表达载体的构建

3．MPH突变体的克隆及原核表达载体的构建

4．甲基对硫磷水解酶MPH和突变体在大肠杆菌中的表达

5. 甲基对硫磷水解酶MPH和突变酶的纯化

6．甲基对硫磷水解酶MPH和突变体酶学性质检测

7．甲基对硫磷水解酶MPH的同源建模分析

8．蛋白质Potential energy的计算

第四部分 结果讨论与进一步工作设想

1． 结果讨论

2． 进一步工作设想

参考文献

致谢

附录