红海榄根部耐盐相关蛋白的分离及质谱鉴定研究

摘要

盐胁迫影响植物生长、降低作物产量。耐盐植物是通过多种生理代谢机制来达到耐盐的目的，其中包括控制离子平衡、离子区隔化、释放无害小分子维持渗透压平衡以及通过氧化还原途径清除盐胁迫下产生的活性氧等。植物的耐盐是一个复杂的数量性状遗传，涉及多基因调控和多种耐盐机制的协调作用。近年来，植物耐盐机理的研究取得巨大进展，许多耐盐关键基因陆续被发现。 本研究从海南热带红树林资源中选取耐盐植物红海榄作为实验材料，通过高通量的蛋白组学方法的研究，分离和鉴定红海榄耐盐相关蛋白和基因，为植物耐盐机理研究提供蛋白组学上的证据。 本实验通过双向电泳技术分析淡栽处理和3％NaCl盐栽处理后的红海榄根部总蛋白，从中筛选差异表达的蛋白质，再经过切胶回收、质谱鉴定，然后根据质谱鉴定结果进行蛋白质数据库检索，寻找其同源蛋白，确定差异表达蛋白的氨基酸序列。 双向电泳图谱的结果表明，蛋白点主要集中在等电点4.0-8.5之间，分子量的分布范围约在28KD-70KD。PDQuest8.0分析软件分析显示，淡栽处理的红海榄根部蛋白质(R0)双向电泳图中共有981个蛋白点，盐栽处理的红海榄根部蛋白质(R3)双向电泳图中有972个蛋白点，其中两个处理的蛋白点匹配成对的数量为874。利用软件定量分析检测出的10倍差异以上的蛋白点，结合凝胶图像直接观察和比较，最终挑选出15个具有较大表达差异的蛋白点进行质谱鉴定。然后将质谱鉴定结果在蛋白质数据库中进行检索，共获得10个阳性结果。这10个盐胁迫下有差异表达的蛋白可被分为几种类型：1)疾病防御和抗逆性相关蛋白，如putativediseaseresistanceprotein(TMVN-like)，MutT/nudixprotein-like，Os01g0149500;2)氨基酸合成和基因表达调控相关蛋白，如eukaryotictranslationinitiationfactor5A，elongationfactor1-alpha，retrotransposonprotein，putative：3)光合作用相关蛋白，如phosphoenolpyruvatecarboxylase，isoform1；4)激素代谢或渗透调节相关酶类，如aci-reductonedioxygenase:5)能量代谢相关的蛋白，如Dynein-1-betaheavychain，flagellarinnerarmIlcomplex(l-betaDHC)；6)未知功能蛋白，如proteinCHLREDRAFT_194002，predictedprotein等。 上述这些蛋白中MutT/nudixprotein-like和Os01g0149500可能是耐盐相关蛋白，参与抗逆性反应，使植物体免遭盐胁迫侵害和适应盐胁迫环境；而retrotransposonprotein,.putative，Ty3-gypsysuclass可能是红海榄在面对盐胁迫时进行表达调控的重要蛋白；aci-reductonedioxygenase则与甲硫氨酸环和膜脂抗氧化有关，盐处理样品的抗氧化过程可能导致其表达量下降；其它蛋白如elonggionfactorl-alpha，phosphoenolpyruvatecarboxylase.isoform1，eukaryotictranslationinitiationfactor5A等可能是耐盐非特异性蛋白。此外，共获得3个功能未知的蛋白质，如proteinCHLREDRAFT_194002，predictedprotein，unknownprotein，其功能有待进一步研究。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词

声明

1序言

1.1红树林植物耐盐分子机理研究进展

1.2蛋白组学研究进展及关键技术概述

1.2.1蛋白质组学概述

1.2.2蛋白质组学分析技术

1.3本研究的目的和意义

2材料与方法

2.1实验材料的选择、采集和处理

2.1.1实验材料的选择

2.1.2实验材料的采集和处理

2.2实验方案和技术路线

2.3实验方法

2.3.1红海榄根部总蛋白质的提取

2.3.2蛋白质的定量分析

2.3.3蛋白质双向电泳及凝胶检测

2.3.4 2-D凝胶图像的软件分析

2.3.5差异蛋白点凝胶胶内酶解及质谱鉴定

3结果分析

3.1实验材料的处理

3.2红海榄根部总蛋白质的提取

3.2.1各种方法提取红海榄根部总蛋白结果的比较

3.2.2酚改良法的建立和其提取红海榄根部总蛋白结果

3.3蛋白质的定量分析

3.4蛋白质双向电泳及凝胶的软件分析结果

3.5差异蛋白点凝胶胶内酶解及质谱分析

3.6质谱鉴定结果在蛋白质数据库中的检索

R02样品

R04样品

R05样品

R06样品

R08样品

R31样品

R33样品

R34样品

R35样品

R36样品

4讨论

4.1实验可行性分析

4.2实验材料的选取

4.3红海榄根部蛋白提取方法的建立

4.4等电聚焦体系的优化

4.5质谱鉴定的蛋白在耐盐机理中的作用及功能预测

4.5.1疾病防御和抗逆性相关蛋白

4.5.2氨基酸合成和基因表达调控相关蛋白

4.5.3光合作用相关蛋白

4.5.4激素代谢和渗透调节相关酶类

4.5.5物质和能量代谢相关的蛋白

4.5.6未知功能的蛋白

5结论

参考文献

致谢