老鼠簕内生放线菌的分离鉴定活性评价及其类群分析

摘要

植物内生放线菌是重要的药用微生物资源，老簕革是一种药用红树林植物，在民间一直以来作为传统药用植物使用。从广东深圳、湛江，海南东寨港、清澜港、广西北海五个地点采集了老鼠簕全株样品，通过乙醇、氯化汞对样品进行表面消毒，选用Gause、RH、SM2、M5、OAS、OA7、OA9、OA11和1/10ATCC172等九种分离培养基，结合放线菌酮、制霉菌素、新生霉素、萘啶酮酸和重铬酸钾等五种抗生素或抑制剂，对每个样品根、茎、叶、花、果等五种组织部位进行了内生放线菌的分离。结果总共分离得到了52株内生放线菌，以根为分离材料得到的菌株数量最多，未从花和果上分离出；用OA7和1/10ATCC172两种分离培养基分离得到的菌株数量最多；以海南清澜港采集的植株材料分离获得的菌株数最多。 检测了所有52株菌株的体外抗菌活性和细胞毒活性，结果显示5株具有抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌活性，占总菌株数的9.6％;有2株具蛋自酪氨酸磷酸酯酶抑制剂活性，占总数的3.8％；有1株对结肠癌HCT116细胞株具有细胞毒活性，占总菌株数的1.9％。以根为材料分离得到的活性菌株数最多，以海南清澜港采集的材料分离获得的最多。所有测试菌株均未检测到抗白色念珠菌活性。通过对所有菌株进行耐盐性试验发现，有18株的最大耐盐度能够达到20％，有12株的最适耐盐度为3.3％，有4株不能在0％却能在3.3％或以上生长，有3株菌株不能在3.3％以上生长。 对分离到的所有菌株进行了菌落形态、培养特征、细胞壁氨基酸、全糖分析和16SrDNA部分序列分析，分类鉴定到属。本研究分离得到的内生放线菌分为3个属，分别为小单孢菌属(Micromonospora)、疣孢菌属(Verrucosispora)和链霉菌属(Streptomyces)，其中以小单孢菌最多。 基于16SrDNA部分序列对所有菌株进行了系统发育树分析，结果表明，来自海南清澜港的菌株多样性最丰富，广东湛江的多样性最低。在分离的菌株中，发现有些相同的小单孢菌属菌株分别可从不同地点的老鼠筋植株或同一植株的不同组织分离到。

目录

文摘

英文文摘

声明

1 序言

1.1植物内生菌概述

1.1.1植物内生菌的分布

1.1.2植物内生菌次级代谢物

1.2植物内生放线菌

1.2.1放线菌

1.2.2植物内生放线菌

1.2.3植物内生放线菌的应用

1.3红树林内生菌研究现状

1.3.1红树林植物的药用价值

1.3.2红树植物内生茵研究进展

1.4本论文的研究内容及意义

2材料与方法

2.1 红树林植物老鼠箭样品的采集

2.2内生放线菌的选择性分离

2.2.1样品预处理

2.2.2表面消毒

2.2.3分离培养

2.2.4表面消毒的检验

2.2.5菌种纯化

2.2.6菌种保藏

2.2.7发酵培养

2.3活性检测

2.3.1抗耐药性金黄色葡萄球菌的活性检测

2.3.2细胞毒活性检测

2.4菌株形态特征观察

2.5菌株的生理生化特征

2.5.1菌株的耐盐度实验

2.5.2无氮培养基培养

2.6菌株的细胞壁分析

2.6.1氨基酸以及DAP分析

2.6.2细胞壁全糖分析

2.7内生放线菌16S rDNA序列分析

2.7.1菌株DNA的提取

2.7.2 16S rDNA的PCR扩增

2.7.3 16S rDNA测序

2.7.4 16S rEINA的系统发育分析

3结果与分析

3.1红树林植物老鼠筋样品中内生放线菌的分离结果

3.1.1分离培养基对分离结果的影响

3.1.2不同分离部位对分离结果的影响

3.1.3分离地点对分离结果的影响

3.2活性检测

3.2.1抗耐药性金黄色葡萄球菌和白色念珠菌活性检测

3.2.2细胞毒活性检测

3.3形态特征观察

3.4菌株的生理生化特征

3.4.1菌株的耐盐度实验

3.4.2无氮培养基培养

3.5分离菌株的细胞壁氨基酸组成和全糖分析

3.6菌株DNA的提取、16S rDNA扩增、产物纯化及其序列测定

3.7 16S rDNA的系统发育分析

3.7.1根据16S rDNA序列构建的52株内生放线菌及其相关属、种典型菌株的系统发育进化树分析

3.7.2根据分离菌株的16S rDNA序列，采用邻接法构建的47株小单孢茵属内生放线菌及其相关典型菌株的系统发育进化树

3.7.3根据16S rDNA序列构建链霉菌属菌株206108、201206和205201及其相关属、种典型菌株的系统发育进化树

3.7.4疣孢菌属菌株201803和202201及其相关属种的典型菌株利用16S rDNA序列构建的NJ系统发育进化树

4讨论

4.1研究方法对分离结果的影响

4.2老鼠筋内生放线菌的作用与活性评价

4.3关于内生放线菌的分布

4.4关于老鼠筋植物内生放线菌类群

5结论

参考文献

附录

附录：52株的分类特征描述 菌株1-10

附录：52株的分类特征描述 菌株11-20

附录：52株的分类特征描述 菌株21-30

附录：52株的分类特征描述 菌株31-40

附录：52株的分类特征描述 菌株41-52

致谢