钙网蛋白-N58在毕赤酵母中的表达及生物活性分析

摘要

新生血管的形成，是实体肿瘤组织得以浸润性生长和发生转移的必要条件，而成年动物/人在正常的生理状态下不存在新生血管形成，因此，血管生成抑制因子是低毒、无副作用、无抗药性的肿瘤治疗药物。钙网蛋白(calreticulin，CRT)是高等动物细胞中普遍存在的一种钙结合蛋白，具有分子伴侣、结合钙、信号转导、细胞吸附和基因表达调控等功能。Vasostatin是CRT蛋白N-端结构域片段第1-180个氨基酸，是一种新型的血管生成抑制因子，具有抑制内皮细胞增殖、抑制血管生成的生物功能。有研究表明其主要活性部位存在于第120-180个氨基酸片段中。为了寻找高效和小分子量的血管生成抑制因子，本研究采用PCR技术扩增CRT基因N端的第122-180位氨基酸的DNA片段，将CRT-N58基因克隆至毕赤酵母表达载体pPIC9K中，获得重组质粒pPIC9K-CRT-N58，用SalI线性化重组质粒后，电激转化感受态酵母菌株GS115，构建了能分泌表达CRT-N58蛋白的酵母工程菌GS115(pPIC9K-CRT-N58)。经MD板和不同浓度G418筛选得到多拷贝重组菌株，重组菌株在甲醇诱导下分泌表达目的蛋白。SDS-PAGE分析结果显示，在甲醇诱导下，CRT-N58蛋白成功地获得了分泌表达。经过初步纯化，将目的蛋白进行CAM血管生成抑制活性分析，实验结果证明分泌表达的CRT-N58蛋白能抑制CAM血管的生成。本研究为寻找高效和分子量小的新的血管生成抑制因子和抗癌蛋白打下了良好基础。本实验成功地在毕赤酵母表达系统中实现了Calreticulin-N58的分泌表达，为Calreticulin-N58蛋白的进一步药用研究奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

1引言

1.1血管生成抑制因子的研究背景

1.1.1血管生成抑制因子抗肿瘤的原理

1.1.2血管生成抑制因子的研究进展

1.1.3钙网蛋白的研究进展

1.2毕赤酵母表达系统的研究进展

1.2.1 pichia pastoris表达系统的优点

1.2.2优化毕赤酵母表达体系

1.3本项研究的目的意义、内容和技术路线

1.3.1目的意义

1.3.2研究内容

1.3.3技术路线

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1质粒和菌株

2.1.2主要试剂和工具酶

2.2方法

2.2.1 CRT-N58基因构建

2.2.2酵母重组表达载体的构建及鉴定

2.2.3 CRT-N58基因在Pichia pastoris中的诱导表达

2.2.4 Tricine-SDS-PAGE

2.2.5重组酵母甲醇诱导条件的优化

2.2.6重组蛋白CRT-N58的初步纯化

2.2.7鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成抑制活性的测定

3实验结果

3.1 CRT-N58基因克隆与分泌型表达载体的构建

3.2含CRT-N58基因的酵母工程菌构建

3.2.1酵母转化

3.2.2在G418平板上筛选高拷贝整合的重组转化子

3.2.3 PCR法检测阳性转化子

3.2.4甲醇诱导条件的优化

3.2.5表达产物的Tricine-SDS-PAGE检测

3.2.6 CRT-N58蛋白对鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成的抑制作用

4讨论

4.1 CRT-N58蛋白的开发前景

4.2表达体系的选择

4.3CRT-N58蛋白的分子量

4.4试验中采用的一些简便、有效的方法

4.5本研究值得改进的地方和进一步研究的打算

5结论

参考文献

附录：缩写词(Abbreviation)

致谢