树干毕赤酵母中参与木质纤维素水解液中醛类抑制物脱毒相关酶基因的克隆、表达及活性分析

摘要

木质纤维素，因其具有可再生性、价格低廉以及来源广泛等诸多优点，被认为是燃料乙醇生产的最佳原料。然而，所有的发酵微生物均不能直接有效地发酵木质纤维素生成乙醇，必须在发酵前进行预处理。在此过程中，不可避免地会产生对发酵微生物有强烈抑制作用的有毒副产物，即抑制因子。在众多的抑制因子中，醛类是最为关键的抑制因子。与天然的发酵微生物酿酒酵母相比，树干毕赤酵母不仅能发酵木质纤维素水解产物中的五碳糖，而且还能分泌多种能降解木质纤维素的水解酶。因此，该酵母菌被认为是较为理想的木质纤维素乙醇发酵微生物。人们已对酿酒酵母中与醛类脱毒相关的酶基因进行了较为深入的研究，而对树干毕赤酵母的研究还未见报道。由于这两种酵母菌在分类上存在较远的亲缘关系，必须对树干毕赤酵母中与醛类脱毒相关的酶基因单独开展研究。
　　本论文以树干毕赤酵母（Scheffersomyces stipites）模式菌株CBS6054为实验材料，借鉴酿酒酵母研究中的结果，选择了树干毕赤酵母基因组中3个基因家族SsADH、SsAAD、SsALD以及1个单独SsGRE2基因作为目的基因，开展了这些基因对关键醛类抑制因子糠醛和5-羟甲基糠醛的转录应答分析。然后将这些基因分别在酿酒酵母中进行过量表达及表达蛋白的功能分析，同时开展了编码蛋白的氨基酸序列分析，获得实验结果如下:
　　(1)通过细胞生长实验的比较分析，发现树干毕赤酵母的生长在初期会受到糠醛或5-羟甲基糠醛的抑制，经过一段时间的迟滞期后又会重新恢复细胞生长。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术，我们开展了树干毕赤酵母中3个基因家族SsADH、SsAAD、SsALD以及1个单独SsGRE2基因共20个目的基因在迟滞期内对糠醛或5-羟甲基糠醛应激条件下转录变化的绝对定量分析。结果发现，在SsADH家族的7个基因中，SsADH4和SsADH6的转录水平在糠醛和5-羟甲基糠醛应激条件下均有了显著提高，转录数量最高上调了150倍。在SsAAD家族的5个基因中，SsAAD3在糠醛和5-羟甲基糠醛应激条件下均显著提高，转录数量最高上调8倍。SsGRE2在糠醛和5-羟甲基糠醛应激条件下均显著提高，转录数量最高上调了26.5倍。在SsALD家族的7个基因中，SsALD6在糠醛应激条件下转录数量上调了5.5倍，SsALD3在5-羟甲基糠醛应激条件下表达量上调1.5倍。其它基因的表达量在这两种醛应激条件下无明显上调，有的甚至出现下降。
　　(2)采用PCR技术扩增获得了20个目的基因的编码序列，分别构建了重组穿梭质粒，并且在酿酒酵母实验菌株中获得了成功表达。表达蛋白的酶学性质研究发现，在SsADH家族中，SsAdh4p、SsAdh5p、SsAdh6p以及SsAdh7p可同时以NADH和NADPH为辅酶对糠醛有活性，而SsAdh1p只能以NADH为辅酶对糠醛有活性。SsAdh4p、SsAdh5p、SsAdh6p以及SsAdh7p只能以 NADPH为辅酶对5-羟甲基糠醛有活性。这些酶催化反应的最适pH均为6.0，最适温度均为30℃。在以NADH为辅酶时，SsAdh7p对糠醛的亲和力最强（Km，1.94±0.02mM）;而在以NADPH为辅酶时，SsAdh4p对糠醛和5-羟甲基糠醛催化的亲和力最强(Km，0.24±0.02mM和0.26±0.03mM)。在SsAAD家族中，所有的5个编码蛋白均能以NADH为辅酶对糠醛有活性，而仅有SsAad2p在以NADPH为辅酶时对5-羟甲基糠醛有活性。所有蛋白催化糠醛和5-羟甲基糠醛反应的最适pH值在6.0-7.0之间，适温度在30℃左右。在以NADH为辅酶时，SsAad4p对糠醛的亲和力最强(Km，3.24±0.03mM)，但SsAad5p对糠醛的催化效率最高（Kcat/Km，78.51±1.82mM-1 min-1）。SsGre2p能利用两种辅酶对糠醛表现出活性，但仅能利用NADPH为辅酶对5-羟甲基糠醛表现出活性。以NADH为辅酶催化糠醛反应时的最适pH值为6.0，以NADPH为辅酶催化糠醛和5-羟甲基糠醛反应时的最适pH值均为7.0。以NADH和NADPH为辅酶还原糠醛时的最适温度均为20℃，但以NADPH为辅酶还原5-羟甲基糠醛时的最适温度则为40℃。在以NADH为辅酶情况下，SsGre2p对糠醛的亲和力最强(Km，0.36mM)。在SsALD家族中，无论是以糠醛还是5-羟甲基糠醛为底物，在两种辅酶的作用下所有目的蛋白均表现出较弱的催化活性。
　　(3)以其它9种醛类（大部分为木质纤维素水解液中的醛类因子）为底物的酶活实验研究发现，在SsADH家族中，大多数蛋白对大部分的供试醛表现出活性。SsAdh1p在以NADH为辅酶时对乙醛的活性最高(883.07±8.23U/mg)。在SsAAD家族中，SsAad2p和SsAad3p在以NADH为辅酶时对7种以上的醛表现出活性。而SsAad4p则在以NADPH为辅酶时对6种醛表现出活性。其中SsAad2p在以NADH为辅酶时对乙醛的活性最高(208.45±5.36U/mg)。SsGre2p对所有的供试醛类都表现出活性。在以NADPH为辅酶时对苯乙醛的活性最高(25.72±0.29U/mg)。在SsALD家族中，SsAld1p、SsAld4p和SsAad7p对供试醛类的活性较为广泛。其中SsAld1p在以NADH为辅酶时对乙醛的活性最高(112.83±4.02U/mg)。
　　(4)目的蛋白的氨基酸序列分析结果显示，SsADH家族中的7个蛋白均属于中链脱氢酶(MDR)，SsAAD家族中的5个蛋白，除SsAad1p属于短链脱氢酶(SDR)之外，其余蛋白均属于具有锌离子结合位点的中链脱氢酶(MDR)。而SsGre2p属于短链脱氢酶(SDR)。同时，在所有的20个目的蛋白氨基酸序列中，发现了一些相应的保守序列。例如，辅酶结合区域和催化区域等。
　　本论文研究从树干毕赤酵母基因组测序推定的可能编码醛还原酶基因中，成功鉴定出了对木质纤维素水解醛类具有脱毒能力的基因。初步探讨了这些基因对糠醛和5-羟甲基糠醛的转录应答反应，较为系统地分析了编码蛋白的酶学性质。通过综合比较分析，发现了树干毕赤酵母中在糠醛和5-羟甲基糠醛脱毒中最为关键的酶基因及参与脱毒的机理。本研究还发现了一些在其它醇类燃料生产中具有潜力的醛还原酶基因。本论文研究获得的成果，有助于增加对树干毕赤酵母对木质纤维素水解醛类抑制因二脱毒机制的了解，可为新酶的开发利用提供借鉴与参考，为树干毕赤酵母醛类抑制因子耐受的育种改造提供指导，为推进木质纤维素燃料乙醇的工业化生产做出贡献。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 人类的能源利用史

1．2 国内外能源的利用概况

1．2．1 化石能源

1．2．2 可再生能源

1．2．3 核能

1．3 生物质能源的开发与利用

1．3．1 生物质能源的概念

1．3．2 生物质能源的特点及利用前景

1．4 木质纤维素生物质发酵产燃料乙醇

1．4．1 木质纤维素生物质发酵产燃料乙醇的研究概况

1．4．2 木质纤维素生物质发酵产乙醇的技术方法

1．5 酵母菌的原位脱毒研究概况

1．5．1 主要的呋喃醛类水解副产物简介

1．5．2 酵母菌原位脱毒机制的研究进展

1．5．3 树干毕赤酵母简介

1．6 本论文的目的与意义

1．7 技术路线

第二章 树干毕赤酵母中醇脱氢酶(ADH)基因家族的转录应答、克隆表达以及对醛类抑制物的活性分析

2．1 实验材料

2．1．1 实验使用菌株和质粒

2．1．2 主要使用仪器及设备

2．1．3 主要使用试剂及配方

2．2 实验方法

2．2．1 目的基因的转录应答分析

2．2．2 目的基因的克隆

2．2．3 重组酵母表达菌株的构建

2．2．4 目的蛋白质的诱导表达与纯化

2．2．5 目的蛋白质的功能分析

2．2．6 氨基酸序列分析

2．3 结果与分析

2．3．1 目的基因的转录应答分析

2．3．2 目的基因的克隆及重组酵母表菌株的构建

2．3．3 目的蛋白质的表达及纯化

2．3．4 目的蛋白质的活性分析

2．3．5 氨基酸序列分析

2．3 讨论

2．3 结论

第三章 树干毕赤酵母中芳香醇脱氢酶(AAD)基因家族的转录应答、克隆表达及对醛类抑制物的活性分析

3．1 实验材料

3．1．1 实验使用菌株和质粒

3．1．2 主要使用仪器及设备

3．1．3 主要试剂及配方

3．2 实验方法

3．2．1 目的基因的转录应答分析

3．2．2 目的基因的克隆

3．2．3 重组酵母表达菌株构建

3．2．4 目的蛋白质的诱导表达与纯化

3．2．5 目的蛋白质的功能分析

3．2．6 氨基酸序列分析

3．3 结果与分析

3．3．1 目的基因的转录应答分析

3．3．2 目的基因的克隆及重组酵母表达菌株的构建

3．3．3 目的蛋白的表达及纯化

3．3．4 目的蛋白的活性分析

3．3．5 氨基酸序列分析

3．3 讨论

3．3 结论

第四章 树干毕赤酵母中醛还原酶基因(GRE2)的转录应答、克隆表达及对醛类抑制物的活性分析

4．1 实验材料

4．1．1 实验使用菌株和质粒

4．1．2 主要使用仪器及设备

4．1．3 主要试剂及配方

4．2 实验方法

4．2．1 目的基因的转录应答分析

4．2．2 目的基因的克隆

4．2．3 重组酵母表达菌株的构建

4．2．4 目的蛋白质的诱导表达与纯化

4．2．5 目的蛋白质的功能分析

4．2．6 氨基酸序列分析

4．3 结果与分析

4．3．1 目的基因的转录应答分析

4．3．2 目的基因的克隆及重组酵母表菌株的构建

4．3．3 目的蛋白质的表达及纯化

4．3．4 目的蛋白质的活性分析

4．3．5 氨基酸序列分析

4．3 讨论

4．4 结论

第五章 树干毕赤酵母中醛脱氢酶(ALD)基因家族的转录应答、克隆表达及对醛类抑制物的活性分析

5．1 实验材料

5．1．1 实验使用菌株和质粒

5．1．2 主要使用仪器及设备

5．1．3 主要试剂及配方

5．2 实验方法

5．2．1 目的基因的转录应答分析

5．2．2 目的基因的克隆

5．2．3 重组酵母表达菌株的构建

5．2．4 目的蛋白质的诱导表达与纯化

5．2．5 目的蛋白质的功能分析

5．2．6 氨基酸序列分析

5．3 结果与分析

5．3．1 目的基因的转录应答分析

5．3．2 目的基因的克隆及重组酵母表菌株的构建

5．3．3 目的蛋白的表达及纯化

5．3．4 目的蛋白质的活性分析

5．3．5 氨基酸序列分析

5．3 讨论

5．3 结论

第六章 主要创新点及研究展望

6．1 主要创新点

6．2 研究展望

参考文献

致谢

攻读博士研究生学位期间取得的研究成果

附录