枯草芽孢杆菌分子分型及其对海水水质净化效果的研究

摘要

枯草芽孢杆菌可将水体中有机物分解为小分子的有机酸、氨基酸等物质，因此，它是水产养殖系统中最有效的水质净化菌种之一。本文首先建立了枯草芽孢杆菌的PCR快速鉴定方法，然后对海南岛不同地理来源的多种海水水体开展了枯草芽孢杆菌的分离、纯化和鉴定以及对各菌株进行了RAPD分型的工作，同时研究了不同遗传型菌株的水质改良效果，具体结果如下： 1、以枯草芽孢杆菌的gyrB基因设计了2对特异性引物，分别为F1、F2。以标准的枯草芽孢杆菌做PCR检测，结果表明，F1和F2能获得分子量分别为387bp和362bp的目的条带。利用其它12株非枯草芽孢杆菌进行PCR特异性检测，结果表明引物对F1和F2的特异性较强，从而首次成功建立了枯草芽孢杆菌的PCR快速鉴定方法。 2、本文首次以海南岛多个地理来源的不同水体为菌种分离对象，结合传统的生化鉴定手段，采用选择性培养基和本文建立的PCR快速检测方法共分离、纯化和鉴定了45株枯草芽孢杆菌菌株，这些菌株的主要来源地为海口、文昌、万宁、陵水、乐东、东方、三亚，分别分离得到17株、1株、19株、3株、1株、4株和1株。 3、利用RAPD分子标记技术对46株(包括枯草芽孢杆菌标准株ctccAB90008)枯草芽孢杆菌进行了分子分型。为了提高RAPD技术稳定性和可重复性，本文首先优化了模板DNA浓度、dNTPs浓度、Mg2+浓度、引物浓度、TaqDNA聚合酶浓度以及退火温度和时间、延伸时间、循环次数等RAPD技术的主要影响因素，最终建立了适用于枯草芽孢杆菌的最佳RAPD反应体系，即在25μl的总体系中，包括10×PCRbuffer2.5μl，Mg2+(25mmol/L)为2μL，dNTPs(2.5mmol/L)为2μL，引物(10μmol/L)为1μL，DNA聚合酶1.0U，DNA模板2.0μL；循环参数为：94℃预变性4min，94℃变性45s、38℃退火45s、72℃延伸1。5min，共40个循环，72℃延伸7min。通过对60条RAPD随机引物的筛选，共获得11条对该菌扩增效果稳定、多态性丰富的随机引物，选用上述11条引物对46个菌株基因组DNA进行PCR扩增，结果表明，这46株枯草芽孢杆菌具有丰富的遗传多样性，共产生了1802条扩增条带，这些条带呈100％的多态性，即这些引物都能单独使这46株菌株产生特异性的指纹图谱，因此，本文为上述枯草芽孢杆菌菌株建立了一种极有效分子鉴定方法。根据UPGMA方法建立了所有菌株的系统进化树，结果表明，在遗传距离大约为0.53的位置，可以将46个菌株分成14个基因型，分别为A～O型、，其中大多数的菌株集中在第K型和第L型，且绝大多数相同地理来源的菌株具有更近的亲缘关系。 4、根据RAPD技术的分型结果，本文从14个遗传型中分别随机选取1株枯草芽孢杆菌进行水质改良效果研究，测定的水质因子有水体COD、氨氮和pH，结果表明，菌株WC07001和菌株WL07003的水质改良效果明显，且菌株WC07001对氨氮的降解作用最佳，而菌株WL07003则对COD的降解作用最佳，这表明不同枯草芽孢杆菌菌株可能对水质作用效果不一，因此，在实际应用中，枯草芽孢杆菌应以不同的菌株组合成复合菌方能达到最佳的水质改良效果。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

1芽孢杆菌的分类方法的发展

2芽孢杆菌的应用研究现状

2.1在水产养殖中的应用

2.2在农业中的应用

2.3在工业中的应用

2.4在医疗卫生中的应用

2.5在基因工程研究中的应用

3本研究目的和意义

第二章实验研究

前言

第一节枯草芽孢杆菌PCR快速检测方法的建立

1材料与方法

2结果与分析

3、讨论

第二节枯草芽孢杆菌的分离与鉴定

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

第三节枯草芽孢杆菌的RAPD分析

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

第四节不同遗传型的枯草芽孢杆菌对水质改良效果的研究

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

附图（RAPD电泳图）

致谢

参考文献