碳离子束辐照谷氨酸棒杆菌高产菌株选育研究

摘要

本论文选用中国科学院近代物理研究所兰州重离子加速器国家重点实验室(Heavy Ion Research Facility in Lanzhou，HIRFL)提供的能量为80 MeV/u的12C6+离子束辐照诱变谷氨酸生产菌——谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，先后使用高葡萄糖(Glucose)、高谷氨酸(Glutamic Acid)、谷氨酰胺(Glutamine)、琥珀酸(Succinic Acid)等配制选择性培养基初步筛选出具有优良发酵潜力的谷氨酸生产菌株，然后进行24孔深孔细胞培养板进行高通量发酵初筛实验，最后通过摇瓶发酵复筛实验选育出谷氨酸生产量提高的突变菌株，并进行稳定性传代实验，以期获得一些其它诱变方法难以获得的高产谷氨酸突变菌株，拟解决谷氨酸工业生产中存在的糖酸转化率低等问题。同时用分子生物学方法研究玉米浆添加量对突变菌株谷氨酸合成代谢关键酶基因的影响，探讨谷氨酸棒杆菌在发酵生产时的代谢机制，为进一步提高谷氨酸产量奠定一定的分子生物学研究基础。
　　通过本论文的实验研究，得到了以下初步结果：
　　1.菌体在完全培养基中活化生长8-9 h，处于对数生长期的中后期，此时菌体的繁殖能力比较强，菌体 OD660值约为0.200-0.220(菌体浓度约为108个菌)，菌浓度相对较大，生物活性较高，是辐照诱变的最佳时机。谷氨酸棒杆菌对重离子辐照较为敏感，辐照后存活率急剧下降，在600 Gy剂量下，致死率达90％。
　　2.利用选择性平板筛选具有特殊抗性的突变菌株，不仅使得诱变实验目的增强，而且大大减少了工作量。通过重离子辐照后筛选获得耐高糖、耐高温等抗性菌株共146株，其中200-400 Gy辐照剂量下获得的突变体有77株，占突变体总数的52.74%。
　　3.初步实验表明，利用24孔深孔细胞培养板进行谷氨酸微量发酵实验具有可行性，可替代摇瓶初筛实验，加快了筛选效率。经过发酵条件实验得到24孔板最佳装液量为1.2 mL，最佳种子培养时间为8-9 h，将该技术应用于谷氨酸菌种产酸初筛取得较好的结果，共获得产酸高于对照的突变体15株。再进行摇瓶复筛，发现 G007号突变体产酸最高，发酵产酸达42.83 g/L，高于对照10.38%，命名为 GM001。经过发酵稳定性实验，GM001遗传性状稳定。
　　4.通过对影响谷氨酸生产菌产酸的几个重要因素(葡萄糖浓度、玉米浆浓度、初始尿素添加量、培养温度、溶氧、pH值)进行优化研究，同时通过正交实验得出最佳培养基配比及发酵条件为：葡萄糖200 g/L，玉米浆6.0 g/L，初始尿素3.0 g/L，温度32-38℃，摇床转速(溶氧)120-200 r/mim，初始 pH值6.5-8.0。
　　5.通过重离子辐照得到高产谷氨酸突变菌株 GM001，生长速率提高，发酵对数期提前，对缩短发酵周期，降低发酵成本有积极的作用。发酵38 h后，谷氨酸产率达到121.1 g/L，与出发菌株酸度值相比提高了10.09%，葡萄糖利用率也提高至94.72%。GM001连续发酵5次，最后产酸稳定在119.8 g/L-121.1 g/L，与原始菌种相比，提高约10.0%，可以看出 GM001是一株很有前景的工业生产菌株。
　　6.通过不同玉米浆浓度对谷氨酸发酵关键酶表达影响的研究，发现玉米浆浓度对谷氨酸发酵关键酶具有显著地影响。玉米浆浓度在生长时期和产酸时期对各种关键酶基因表达的影响不同，如在菌体生长时期，异柠檬酸脱氢酶(Isocitrate dehydrogenase，IDH)的表达随玉米浆浓度的升高而降低；而在产酸期，异柠檬酸脱氢酶的表达在中低浓度玉米浆添加量时随浓度的升高而升高。研究结果表明，6.0 g/L的玉米浆添加量对谷氨酸产生及积累有促进的作用。

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西北师范大学研究生学位论文作者信息

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缩略语

1 综 述

1.1 重离子束的特点及其在生物辐射育种中的优势

1.2 谷氨酸生产及菌种选育研究概况

1.3 本论文的研究内容与创新点

2 材料与方法

2.1 实验材料及试剂

2.2 实验方法

2.3 分析检测

2.4 数据处理

3 结果与讨论

3.1 前言

3.2 12C+6离子束辐照诱变谷氨酸棒杆菌

3.3 高产谷氨酸菌株筛选

3.4 谷氨酸发酵生产条件优化

3.5 高产突变株GM001发酵参数研究及稳定性测试

3.6 玉米浆添加量对谷氨酸发酵关键酶的影响

4 结 论

参考文献

攻硕期间发表的与学位论文相关的科研成果目录：

致谢