红海榄脱水素基因的克隆及转化研究

摘要

红树林生长于热带、亚热带陆海交汇的海湾河口潮间带,长期生长在高盐、高渗透压下的海水环境中,已进化出一套有别于陆生植物或淡水生植物的耐盐机制,属于真正的盐生植物。红海榄(Rhizophora stylosa)是这类植物中比较典型的一种,它属于红树科(Rhizophoraceae)红树属(Rhizophora),耐盐优势明显,是研究植物耐盐机制的理想材料。为了克隆红海榄的耐盐相关基因,本实验室在前期试验中构建了红海榄cDNA文库,然后将红海榄幼苗分别进行淡栽和盐栽处理,通过基因芯片分析在其根部差异表达基因,找到了一些有明显差异表达的cDNA片段。本文采用RT-PCR和cDNA末端快速扩增(RACE)技术,克隆了其中一个差异表达片段的全长cDNA序列,该序列包括146bp的5'端非编码区,43bp的3'端非编码区和一个编码241个氨基酸的开放阅读框。该cDNA编码的蛋白具有植物脱水素蛋白的特征性结构,属于SKn类脱水素蛋白,我们将之命名为RsDHN1,与其它植物的SKn类脱水素蛋白具有43-55％的氨基酸序列同源性,序列存在较大差异。半定量RT-PCR分析表明,盐胁迫对RsDHN1的表达有明显上调作用。
　　 为了深入研究这些基因的功能,我们构建了红海榄耐盐相关基因RsDHN1和RsGLP基因的植物表达载体并进行植物转化,通过抗生素抗性筛选,得到了RsDHN1基因的烟草转化植株和RsGLP基因的水稻转化植株。两基因转化植株的耐盐性状将在后续试验中鉴定。在RsGLP基因的GFP融合表达转基因植株的荧光细胞定位分析中,发现RsGLP基因在细胞中分布在细胞壁位置。这些研究结果为鉴定红树耐盐基因和理解红树耐盐机理做了初步探讨,并为红树耐盐基因在培育耐盐作物品种的研究打下了良好的基础。

目录

文摘

英文文摘

1 前言

1.1 植物耐盐基因研究进展

1.1.1 渗透调节相关基因

1.1.2 离子调节相关基因

1.1.3 氧化调节相关基因

1.1.4 水分胁迫相关的蛋白基因

1.1.5 盐胁迫信号传导调控相关基因

1.2 红树耐盐相关基因的克隆及研究进展

1.3 农杆菌转化研究进展

1.3.1 农杆菌介导转化机理

1.3.2 农杆菌转化的影响因素

1.4 本研究的目的意义和技术路线

2 实验材料和方法

2.1 实验材料

2.1.1 植物材料

2.1.2 实验试剂和材料

2.1.3 菌株和质粒

2.2 实验方法

2.2.1 红海榄脱水素基因cDNA的全长克隆

2.2.2 红海榄脱水素基因表达载体的构建及转化

2.2.3 红海榄萌发样蛋白基因的表达分析及载体的构建和转化

3 结果和分析

3.1 红海榄脱水素基因

3.1.1 红树总RNA的提取

3.1.2 红树cDNA第二链的合成

3.1.3 RsDHN1基因cDNA 5'端分离

3.1.4 RsDHN1基因全长cDNA的克隆

3.1.5 RsDHN1基因的生物信息学分析

3.1.6 盐胁迫对RsDHN1基因表达的影响

3.1.7 RsDHN1基因植物转化分析

3.2 红海榄萌发样蛋白基因

3.2.1 盐胁迫对RsGLP基因表达的影响

3.2.2 RsGLP基因植物转化分析

4 讨论

4.1 红海榄脱水素基因的克隆

4.2 GLP基因的讨论

4.3 烟草的转化

5 结论

参考文献

附录一:培养基

附录二:缩写词(Abbreviation)

致谢