沙冬青脱水素基因的克隆及对烟草的遗传转化

摘要

本论文成功克隆了耐旱植物沙冬青中的脱水素基因，构建了植物表达载体并通过农杆菌介导法将其导入烟草中，获得了PCR检测阳性的转基因植株，为研究脱水素基因在转基因植物中的表达奠定基础。主要研究内容与结果如下： 1、根据沙冬青脱水素基因cDNA序列设计特异引物，以沙冬青基因组DNA为模板进行特异性扩增，成功克隆了该脱水素基因。该基因全长1106bp，没有内含子，开放阅读框长552bp，5'UTR98bp，3'UTR456bp，编码一条183个氨基酸的多肽。 2、利用含有BstEⅡ和BglⅡ限制性内切酶位点的特异引物从重组的克隆载体中PCR获得目的片段，并将其定向插入到植物表达载体pCAMBIA3301的GUS表达区，获得重组表达载体pCAMBIA3301—DHN，通过冻融法将此表达载体导入农杆菌LBA4404中，提取转化质粒，经PCR鉴定表明脱水素基因植物表达载体构建成功。 3、以烟草无菌苗叶片为转化受体材料，用携带脱水素基因的表达载体的根癌农杆菌进行叶盘转化，获得Kan抗性植株。提取转化植株总DNA，以重组表达载体为阳性对照，以非转基因植株为阴性对照，对转化植株进行PCR扩增，证明脱水素基因转到了烟草中。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

1引言

1.1脱水素的研究进展

1.1.1脱水素的性质特点

1.1.2脱水素的结构特征

1.1.3脱水素的分类

1.1.4脱水素的分布及组织、亚细胞定位

1.1.5脱水素在细胞内的运转

1.1.6脱水素的表达与调控

1.1.7脱水素的功能

1.2本项目研究目的、意义

2沙冬青脱水素基因的克隆

2.1实验材料

2.1.1植物材料

2.1.2菌株和质粒

2.1.3主要试剂

2.1.4主要试剂配制

2.1.5培养基

2.2实验方法

2.2.1沙冬青基因组DNA的提取

2.2.2脱水素基因扩增引物的设计

2.2.3目的片段的扩增

2.2.4 PCR产物的回收、纯化

2.2.5目的片段与克隆载体的连接

2.2.6大肠杆菌感感受态细胞的转化

2.2.7重组质粒的检测

2.3结果与分析

2.3.1脱水素基因的扩增

2.3.2目的基因的克隆及PCR检测

2.3.3目的基因的序列测定

2.3.4沙冬青脱水素基因氨基酸序列的同源性比对

2.4讨论

3脱水素基因植物表达载体的构建

3.1材料

3.1.1质粒与菌株

3.1.2酶及主要试剂

3.1.3培养基

3.2方法

3.2.1目的基因扩增引物的设计

3.2.2目的片段的PCR扩增

3.2.3目的片段扩增产物的回收、纯化

3.2.4目的片段和表达载体的酶切及回收、纯化

3.2.5目的片段与载体大片段的连接

3.2.6连接产物的转化

3.2.7表达载体重组子的鉴定

3.2.8重组载体向农杆菌的导入

3.2.4农杆菌重组质粒的检测

3.3结果与分析

3.3.1目的片段的扩增及回收、纯化

3.3.2目的片段及载体的酶切

3.3.3目的小片段与载体大片段的连接转化

3.3.4表达载体重组子的PCR鉴定

3.3.5重组载体向农杆菌的导入及检测

3.4讨论

4脱水素基因对烟草的转化

4.1材料

4.2方法

4.2.1烟草外植体的准备

4.2.2侵染菌液的制备

4.2.3烟草叶盘的转化及其与农杆菌的共培养

4.2.2转化体的筛选和抗性小植株再生

4.2.3转基因植株的检测

4.3结果与分析

4.3.1烟草叶盘的转化及抗性植株的再生

4.3.2转基因植株的PCR检测

4.4讨论

5结论

致 谢

参考文献

作者简介