橡胶树顺式-异戊烯基转移酶基因转录因子的克隆及表达

摘要

天然橡胶是由三叶橡胶树合成分泌的白色胶乳,其主要成分是聚异戊二烯,它具有耐高温、耐磨和高弹性等突出优点。橡胶树的产胶功能主要是靠分布于树体内的乳管系统实现的。橡胶树的天然橡胶是一个大量的顺式异戊二烯聚合而成的高分子量聚合物。胶乳的前体是类异戊二烯,大多数的类异戊二烯前体都是C5复合物异戊烯基焦磷酸(IPP)和它的异构体二甲(基)丙烯基焦磷酸(DMAPP),目前研究表明,IPP和DMAPP可以通过MVA途径和MEP途径合成。从橡胶合成的途径分析,参与橡胶生物合成的关键酶包括IPP异构酶和一系列异戊烯基转移酶,如FPP合成酶,GGPP合成酶,橡胶转移酶(RT)等。
　　 根据橡胶树顺式-异戊烯基转移酶(橡胶转移酶)基因HRT1的序列设计引物,利用GenomeWalking方法从巴西橡胶树的基因组中克隆了HbRT基因的5'调控序列,并将HbRT15'调控序列构建到酵母诱饵载体。通过酵母单杂技术获得了3个具有转录活性的转录因子,分别命名为HbRZ、HbEIN和HbMYC。
　　 生物信息学分析表明,HbRZ编码的蛋白质有156个氨基酸组成,分子量17.5kDa,理论等电点5.92。氨基酸序列分析表明,HbRZ含有典型的Zinc finger结构域,属于ZIP蛋白,该氨基酸序列与蓖麻(Ricinus communis)、葡萄(Vitis vinifera)、大豆(Glycine max)、杨毛果(Populus trichocarpa)的ZIP同源性分别达到66％、62％、62％和62％。HbEIN编码的蛋白质有620个氨基酸组成,分子量70.40kDa,理论等电点5.70。氨基酸序列分析表明,HbEIN含有典型的EIN3 superfamily结构域,属于EIN3类蛋白,该氨基酸序列与蓖麻(Ricinus communis)、毛果杨(Populus trichocarpa)、甜瓜(Cucumis melo)、烟草(Nicotiana tabacum)、豇豆(Vigna radiata)的EIN家族类转录因子的同源性分别达到88％、82％、76％、71％和70％。HbMYC编码的蛋白质有476个氨基酸组成,分子量53.76 kDa,理论等电点5.73。氨基酸序列分析表明,HbMYC含有典型的E-box/N-boxspecificity site,centromere-binding protein1,cbp-1,HLH superfamily结构域,属于HLH类蛋白,该氨基酸序列与蓖麻(Ricinus communis)、葡萄(Vitis vinifera)、毛果杨(Populustrichocarpa)、甘蓝型油菜(Brassica oleracea)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)的HLH家族类转录因子的同源性分别达到67％、64％、60％、43％和41％。
　　 半定量RT-PCR结果显示:HbRZ在不同组织中的表达量存在差异,胶乳中大量表达,叶片中次之,花中表达最低。HbEIN在不同组织中的表达量也存在差异,在树皮中的表达量最大,叶和芽中的表达次之,花中几乎不表达。HbMYC基因在不同组织中的表达量也存在差异,在胶乳中大量表达,芽和树皮中次之,叶和花中几乎不表达。
　　 乙烯对胶乳HbRZ,HbEIN,HbMYC的表达基本无影响,而茉莉酸处理后胶乳HbRZ的表达下调,HbEIN的表达基本也无影响,HbMYC的表达呈现先上调到2h处理的胶乳样品到达最峰值,再呈现出逐步下调的趋势。

目录

文摘

英文文摘

1 前言

1.1 天然橡胶生物合成的分子机制研究进展

1.1.1 天然橡胶生物合成前体IPP和DMAPP的生成途径

1.1.2 天然橡胶生物合成的MVA途径

1.2 天然橡胶生物合成的激素调节

1.2.1 乙烯对天然橡胶生物合成调节的研究进展

1.2.2 茉莉酸在天然橡胶生物合成中的作用

1.3 cis-prenyltransferases(顺式-异戊烯基转移酶)的研究进展

1.3.1 cis-prenyltransferase在植物中的研究进展

1.3.2 cis-prenyltransferase在橡胶树中的研究进展

1.4 植物启动子及其应用的研究进展

1.4.1 植物启动子的基本特点

1.4.2 植物启动子的转录模式

1.4.3 启动子的克隆方法

1.5 转录因子

1.5.1 转录因子的结构

1.5.2 转录因子的分类

1.5.3 转录因子的调控

1.6 酵母单杂交技术的研究进展

1.6.1 酵母单杂交技术的原理与优点

1.6.2 酵母单杂交技术的应用

1.7 本研究的目的和意义

1.8 本研究的技术路线

2 材料与方法

2.1 材料与试剂

2.1.1 植物材料

2.1.2 质粒及菌种

2.1.3 试剂

2.2 方法与步骤

第一部分 酵母单杂交诱饵载体的构建与3-AT的工作浓度筛选

第二部分 酵母单杂交的胶乳cDNA文库的构建

第三部分 诱饵载体与cDNA文库质粒的大规模杂交筛选

3 结果与分析

3.1 Genomewalker文库的构建与Genomewalker DNA Walking

3.2 橡胶转移酶基因启动子的序列分析

3.3 酵母单杂诱饵载体的构建及验证

3.3.1 诱饵载体的构建

3.3.2 诱饵载体pHis2.1-pHbRT的3-AT浓度的筛选

3.4 cDNA文库的构建

3.4.1 橡胶树胶乳总RNA的提取

3.4.2 cDNA双链的合成

3.5 酵母单杂交筛选胶乳cDNA文库及阳性克隆的筛选

3.5.1 诱饵载体和cDNA文库质粒共转化酵母

3.5.2 阳性克隆的初步筛选

3.5.3 分离cDNA文库质粒

3.5.4 阳性克隆的复筛选(转录因子活性的验证)

3.6 阳性克隆的T7测序和生物信息学分析

3.7 HbRZ,HbEIN,HbMYC的表达分析

3.7.1 HbRZ,HbEIN,HbMYC的组织特异性表达

3.7.2 激素处理对HbRZ,HbEIN,HbMYC,MbRT1,HbRT2的表达影响

4 讨论

4.1 橡胶转移酶基因的5'调控序列分析

4.2 HbRZ、HbEIN利HbMYC转录因子的调控分析

4.3 HbRZ、HbEIN和HbMYC转录因子结构域的分析

4.3.1 HbRZ转录因子结构域的分析

4.3.2 HbEIN转录因子结构域的分析

4.3.3 HbMYC转录因子结构域的分析

4.4 转录因子的研究方法

4.5 酵母单杂交的假阳性问题

5 结论

参考文献

附录 有关试剂的配制

致谢