基因Ⅳ型猪戊型肝炎病毒重组ORF3蛋白的表达、纯化及初步应用研究

摘要

猪戊型肝炎病毒(Swine Hepatitis E Virus,SHEV)开放阅读框3(Open Reading Frame3,ORF3)在病毒感染细胞而引发的信号转导过程中发挥着极其重要的作用。本实验以pMD18T-ORF3质粒为材料,通过EcoRⅠ和SalⅠ双酶切,将获得的ORF3片段克隆至大肠杆菌表达载体pET42(+)中,构建成原核表达载体pET42a-ORF3。经酶切、测序鉴定正确后,将pET42a-ORF3转化大肠杆菌BL21(DE3)。以IPTG诱导融合蛋白His/GST-ORF3表达,并进一步优化IPTG诱导表达条件。SDS-PAGE分析显示His/GST-ORF3在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效表达,表达蛋白分子质量约为45.5ku。对表达的融合蛋白进行Ni2+-NTA柱纯化,以SDS-PAGE检测纯化的表达产物,BandScan4.3生物图像分析软件分析表明:纯化后的融合蛋白纯度达到88％以上。用纯化的融合蛋白作为包被抗原,建立用于SHEV抗体检测的间接ELISA方法。并用该方法检测了来自海口和三亚地区18个猪场的190份猪血清样品,阳性率达84.7％。与商品试剂盒(万泰)检测结果相比,阳性符合率为91.5％。用纯化的融合蛋白皮下多点注射免疫雄性大白兔,制备兔抗SHEV-ORF3多克隆抗血清。用建立的间接ELISA法检测抗血清的效价,结果表明获得的抗血清效价在1:12800以上。Western Blot比较分析也显示:此抗血清具有很强的特异性。此实验结果为进一步研究SHEV-ORF3蛋白的功能以及HEV感染机制奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

第一章 绪论

1.1 研究目的与意义

1.2 文献综述

1.3 技术路线

第二章 基因Ⅳ型猪戊型肝炎病毒重组ORF3蛋白的表达、纯化

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 实验结果与分析

2.3.1 重组表达质粒pET42a-ORF3的构建及鉴定

2.3.2 pET42a-ORF3的诱导表达及条件优化

2.3.3 融合蛋白的可溶性分析

2.3.4 融合蛋白的亲和层析法纯化

2.3.5 表达产物的鉴定

2.4 讨论

第三章 基因Ⅳ型猪戊型肝炎病毒重组ORF3蛋白抗原间接ELISA诊断方法的建立

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 实验结果与分析

3.3.1 间接ELISA诊断方法的建立

3.3.2 临界值确定

3.3.3 特异性试验

3.3.4 重复性试验

3.3.5 敏感性试验

3.3.6 His/GST-ORF3 ELISA与HEV ELISA Kit检测猪血清的结果比较

3.4 讨论

第四章 免抗SHEV-ORF3多克隆抗血清的制备及应用

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 实验结果与分析

4.3.1 抗血清的效价检测

4.3.2 抗血清的特异性鉴定及应用

4.4 讨论

第五章 结论

参考文献

附录

论文说明:英文缩写中英文对照

ORF3测序报告

致谢