红树林细胞毒活性链霉菌061324的分子鉴定及定种

摘要

DNA-DNA杂交(molecular hybridization)技术是分析DNA同源性的一种有效手段,是在16S rDNA序列相似情况下确定新种的必须技术。本研究对传统尼龙膜DNA-DNA杂交技术进行了改进,用核酸限制性内切酶Sau3A分别对待测试菌株和参照菌株的基因组DNA进行消化,再分别与不同的寡核苷酸接头进行连接,然后以相应寡核苷酸接头序列作为引物扩增待测菌和参照菌的基因组DNA,其中参照菌株的DNA用地高辛修饰的dUTP标记。将待测菌的DNA固定于尼龙膜并与地高辛标记的参照菌的DNA进行杂交,再显色。最后用DOTS分析软件分析杂交图,算出其间DNA-DNA杂交值。相对传统的尼龙膜DNA-DNA杂交具有快速,灵敏度高和不需特殊仪器等优点。
　　 菌株061324分离自文昌红树林土壤的一株具有细胞毒活性的放线菌,具有发达、分支、不断裂的基内菌丝和气生菌丝;孢子链长、直或波曲,着生在气丝上,孢子表面光滑,依据形态特征初步归类为链霉菌。根据菌株061324及相近的链霉菌的16S rDNA序列的系统发育分析,菌株061324与Streptomycescheonanensis NBRC100940T和Streptomyces carpaticus AS4.1621T处于一个独立的分支,16S rDNA序列的相似性分别为99.2％和99.4％,DNA-DNA杂交的结果分别为46.7％和48.06％。菌株061324的细胞壁组分中含有LL二氨基庚二酸和甘氨酸,不含特征性糖;甲基萘醌组分为MK-9(H8),MK-9(H6),MK-9(H4);其最大耐盐度达12％;(G+C)mol％为73.03％。确定菌株061324是链霉菌属的一个新的分类单元,定名为文昌链霉菌(Streptomyces wenchangensis)。

目录

文摘

英文文摘

1 前言

1.1 放线菌及其分类系统

1.2 放线菌的分类及发展

1.2.1 传统分类

1.2.2 化学分类

1.2.3 分子分类

1.2.4 多相分类

1.2.5 放线菌分类学研究的发展趋势

1.3 DNA-DNA杂交

1.3.1 DNA-DNA杂交概述

1.3.2 DNA-DNA杂交方法

1.3.3 DNA-DNA杂交对细菌“种”的概念的影响及未来趋势

1.4 本研究课题的提出及目的和意义

2.材料和方法

2.1 实验材料

2.1.1 培养基

2.1.2 供试菌种及来源

2.1.3 实验试剂

2.1.4 试剂配制

2.1.5 仪器设备

2.2 分子鉴定技术路线

2.3 实验方法

2.3.1 参考模式菌株的确定

2.3.2 模式菌株的获取

2.3.3 模式菌株活化培养

2.3.4 DNA-DNA条件优化

2.3.5 一株链霉菌061324的鉴定

3.结果与分析

3.1 参考模式菌株的确定

3.2 模式菌株活化结果

3.3 菌株061324的分子鉴定

3.3.1 菌株061324基因组DNA提取及电泳检测

3.3.2 菌株061324基因组DNA纯度与含量检测

3.3.3 DNA-DNA条件优化

3.3.4 G+C摩尔百分比含量分析

3.4 菌株061324的定种

3.4.1 菌株061324的分子鉴定结果

3.4.2 菌株061324的形态特征鉴定

3.4.3 菌株061324的生理生化特征

3.4.4 菌株061324的化学组分分析

3.4.5 菌株061324的描述

4 讨论

4.1 关于16S RRNA基因序列的分子进化分析

4.2 影响DNA-DNA杂交结果的因素

4.2.1 DNA的纯度

4.2.2 核酸探针

4.2.3 预杂交

4.2.4 杂交的温度

4.2.5 杂交反应时间

4.2.6 洗膜

5 结论

参考文献

致谢