基于琼脂磁珠的核酸信标配基双抗夹心法免疫-PCR检测技术的研究

摘要

随着科学技术的发展，对分子检测技术的特异性、灵敏度将会有更高要求。尤其在基础研究和临床应用中，分子的定性和定量检测具有非常重要的意义。因此，探索新技术或改进现有技术以提高分子水平的精确定量，突破检测技术这一瓶颈，是目前科研工作中的研究热点。
　　本实验以琼脂磁珠为载体，结合核酸信标配基建立一种新型微量蛋白检测方法。为了检测技术的成功建立，本实验进行了不断地摸索，确立了该检测技术的基本流程，即利用琼脂磁珠固定多抗，多抗结合靶标蛋白，再结合一抗，最后与一抗特异性核酸信标配基结合，经过洗脱分离，完成靶标蛋白到核酸信标配基的信号转换，采用实时定量-PCR技术对核酸信标配基进行快速定量检测，间接的完成对靶标蛋白的检测。为了达到最佳检测效果，本实验对相应抗原、抗体最佳稀释倍数、核酸信标配基特异性、核酸信标配基最佳稀释倍数及结合时间、实验洗脱试剂、洗脱方式、封闭效果等各项条件进行了优化改进。结果显示：实验中相应抗原抗体的活性良好且最佳稀释倍数均为100倍；核酸信标配基特异性强（即只和一抗特异性结合），其最佳稀释倍数为50倍，最佳结合时间为30 min；实验最佳洗脱试剂为SSC，最佳洗脱方式为10×SSC、5×SSC、2×SSC依次洗脱；封闭与否效果相似；又对该方法的检测准确性、灵敏度及重复性进行了实验验证。结果显示：优化后的核酸信标配基双抗夹心免疫-PCR检测技术对特异性靶标蛋白识别性强，灵敏度高，定量准确，具有可行性。
　　本技术将核酸信标配基的信号扩增特性与琼脂磁珠的载体特性结合起来，并采用有机溶剂洗脱作为配基筛选分离手段，通过实时定量-PCR完成对靶标蛋白的间接定量检测，这将为定量检测靶标蛋白提供一种快速、灵敏、实用的技术方法。

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西北师范大学研究生学位论文作者信息

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第一章 绪论

1 核酸适配体

1.1 核酸适配体概述

1.2 核酸适配体的应用

2 核酸信标配基

2.1 核酸信标配基简介

2.2 核酸信标配基的构建

2.3 核酸信标配基的检测

3免疫检测技术

3.1免疫检测技术概述

3.2免疫检测技术的发展与应用

4 磁珠简介

4.1磁珠的制备及特性概述

4.2磁珠的应用

5 项目研究的目的及意义

第二章 核酸信标配基双抗夹心免疫-PCR检测技术条件的优化

1 引言

2 实验材料与仪器

2.1 主要实验药品和试剂

2.2 实验试剂的配制

2.3 实验主要仪器

3 实验方法

3.1 琼脂磁珠的活化

3.2 实验相关抗原、抗体活性及其最佳稀释倍数的测定

3.3 核酸信标配基特异性、最佳结合时间及其最佳稀释倍数的测定

3.4核酸信标配基双抗夹心免疫-PCR技术洗脱试剂的优化

3.5 实验结果与分析

4 讨论与分析

第三章 核酸信标配基双抗夹心免疫-PCR蛋白检测

1 引言

2 实验材料和仪器

2.1 实验主要药品和试剂

2.2 实验试剂的配置

2.3 实验主要仪器

3 实验方法

3.1核酸信标配基双抗夹心免疫-PCR蛋白检测

3.2 核酸信标配基双抗夹心免疫-PCR蛋白检测灵敏度验证

3.3 核酸信标配基双抗夹心免疫-PCR蛋白检测重复性验证

4 实验结果与分析

4.1核酸信标配基双抗夹心免疫-PCR蛋白检测

4.2核酸信标配基双抗夹心免疫-PCR蛋白检测灵敏度验证

4.3核酸信标配基双抗夹心免疫-PCR蛋白检测重复性验证

5 讨论与分析

第四章 结论

参考文献

硕士期间的科研成果

附录A

致谢