CryIA(c)-2A-gna融合基因、CryIA(c)和CryIA(b)单价基因遗传转化甘蔗的研究

摘要

甘蔗(Saccharum officinarum L.)是重要的糖料和能源作物,甘蔗生产中螟虫(鳞翅目)、甘蔗绵蚜(同翅目)以及蛴螬(鞘翅目)等害虫的危害已成为其持续、稳定和健康发展的严重障碍。为了使甘蔗抗虫转基因的研究工作更有针对性,我们对海南甘蔗虫害的种类及其危害做了全面的调查,其中红尾白螟、二点螟、条螟、粉蚧、绵蚜,蔗根象等危害最严重,而这些害虫主要集中于鳞翅目、同翅目两大类,该调查结果与全国甘蔗蔗区害虫的危害情况基本一致。
　　 在甘蔗抗虫基因工程中,通过将抗虫蛋白基因导入甘蔗来提高甘蔗结虫害抵抗能力已成为一种直接而有效的方法。随竹越来越多抗虫蛋白被发现,人们都试图采用多基因共表达的策略将多种抗虫蛋白基因转入植物,以提高植物的抗虫能力和扩人抗虫谱。但是,由于受到可选择的载体数目和载体容量的限制,该目的很难较好的实现。融合基因技术的发展成为解决这一难题的有效途径。通过构建融合基因,可以实现多个基因的同步、同水平表达。正是这些优点,融合基因技术越来越受到人们的关注。针对甘蔗生产中鳞翅目、同翅目两大类主要害虫,本研究选择Bt Cry(I)A(c)和gna两个已经证明具有很强抗螟虫和蚜虫能力的抗虫蛋白,采用重叠延伸PCR技术(gcnc splicing by ovcrlapextension PCR,简称SOE PER),通过连接多肽FMDV2A序列将Cry(I)A(c)和gna基因相融合,得到Cry(I)A(c)-2A-gna抗虫融合基因,通过农杆菌介导转化甘蔗,实现两个蛋白在甘蔗体内的共表达,以求达到提高甘蔗对虫害的抵抗能力的目的。主要实验结果如下:
　　 (1)对海南甘蔗产区5个县(市)16个乡镇进行害虫调查,初步摸清了海南甘蔗害虫种类,共发现害虫9目35科58种,其中鳞翅目10科15种,半翅目4科5种,同翅目7科9种,鞘翅目7科12种,直翅目4科12种,蜚蠊目、等翅目、缨翅目和柄眼目各1科1种。分析了甘蔗生产的主要害虫分布、危害特点、发生规律。其中红尾白暝、二点螟、条螟、粉蚧、绵蚜,蔗根象等危害最严重;
　　 (2)将Cry(I)A(c)和gna基因用一段具有自我剪切功能的FMDV2A序列连接子连接,成功了融合Cry(I)A(c)-2A-gna基因;
　　 (3)构建了含有融合基因Cry(I)A(c)-2A-gna的植物表达载体pNUBG。同时构建了Cry(I)A(c)和Cry(I)A(b)两个单独基因的植物表达载体pUBTC和pUBTB,获得的三个植物表达载体用“冻融法”将其导入根癌农杆菌EHA105中;
　　 (4)将三个表达载体分别通过农杆菌介导法对甘蔗进行遗传转化:获得转融合基因Cry(I)A(c)-2A-gna抗性植株196株,转Cry(I)A(c)基因86株,转Cry(I)A(b)基因抗性植株78株。所得的抗性植株进行PCR检测,转Cry(I)A(c)-2A-gna融合基因抗性植株呈阳性的有135株,转Cry(I)A(c)基因的57株,转Cry(I)A(b)基因有52株,初步证明外源基因已整合到甘蔗的基因组中;
　　 (5)选取转融合基因Cry(I)A(c)-2A-gna的6株PCR呈阳性的植株进行Southern blot检测,植株1,2,3,5,6有杂交信号,单拷贝,证明外源基因已整合到甘蔗的基因组中,只有植株4的无杂交信号;
　　 (6)选取转融合基因Cry(I)A(c)-2A-gnar的5株Southern blot呈阳性的植株进行RT-PCR检测,5株转基因甘蔗的外源基因Cry(I)A(c)-2A-gna基因在转录水平上得到了表达;
　　 (7)选取转融合基因Cry(I)A(c)-2A-gna的5株Southern blot检测呈阳性的植株提取植物粗蛋白,进行GNA凝血实验,说明融合基因Cry(I)A(c)-2A-gna中的gna基因在转基因甘蔗植株中有不同程度的表达;
　　 (8)选取转融合基因Cry(I)A(c)-2A-gna的5株Southern blot检测呈阳性的植株提取植物和蛋白,利用Bt-Cry(I)Ab/Ac免疫检测试纸条进行Bt杀虫蛋白检测,全部表现为阳性结果,在Bt-Cry(I)Ab/Ac免疫检测试纸条上出现了两条紫红色条带,一条质控线,一条检测线,说明融合基因Cry(I)A(c)-2A-gna中的Cry(I)A基因在转基因甘蔗植株中得到表农达。

目录

文摘

英文文摘

第一章 引言与文献综述

1 甘蔗概况

1.1 甘蔗害虫种类及其危害

1.2 甘蔗害虫的综合防治

2 植物抗虫基因的研究进展

2.1 抗虫基因及其作用原理

2.2 抗虫基因工程潜在的问题及解决途径

3 甘蔗转基因的研究进展

3.1 甘蔗的遗传背景

3.2 甘蔗转化系统建立和优化

3.3 甘蔗的抗虫转基因研究现状

3.4 甘蔗抗病转基因研究

3.5 甘蔗抗除草剂转基因研究

3.6 提高甘蔗抗逆性的转基因研究

3.7 提高甘蔗蔗糖含量和改良蔗糖色泽的转基因研究

3.8 甘蔗生物反应器研究进展

4 融合基因研究进展

4.1 传统获得多价转基因植物的策略

4.2 利用融合基因获得多价转基因植物的策略

5 本研究的目的意义、内容及技术路线

5.1 研究目的意义

5.2 研究内容

5.3 技术路线

第二章 海南蔗区害虫调查

1 材料与方法

1.1 调查时间与地点

1.2 材料

1.3 调查方法及数据处理

2 结果与分析

2.1 海南甘蔗害虫种类

2.2 甘蔗害虫危害情况

3 讨论

4 小结

第三章 植物表达载体PNUB2AG、PUBTC和PUBTB的构建

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 研究方法

2 结果与分析

2.1 Cry(I)A(c)和gna融合基因植物表达载体的构建

2.2 Cry(I)A(c)和Cry(I)A(b)单价基因植物表达载体的构建

3 讨论

3.1 关于连接多肽FMDV2A序列

3.2 关于重叠延伸PCR技术

4 小结

第四章 Cry(I)A(C)-2A-GNA、Cry(I)A(C)和Cry(I)A(B)基因遗传转化甘蔗

1 材料与方法

1.1 植物材料

1.2 试剂

1.3 主要的甘蔗培养基

2 方法

2.1 甘蔗转化材料及其农杆菌菌液的准备

2.2 农杆菌菌液浸染愈伤组织及共培养

2.3 农杆菌浸染后的愈伤组织分化成苗

2.4 甘蔗小植株的筛选培养

2.5 甘蔗抗性苗的炼苗

3 结果与分析

3.1 甘蔗胚性愈伤组织的诱导及分化成苗

3.2 农杆菌浸染后的愈伤组织分化成苗及其PPT筛选

3.3 甘蔗抗性苗的炼苗

第五章 转基因植株的分子检测及蛋白表达分析

1 材料与方法

1.1 植物材料:PPT抗性筛选后阳性转化甘蔗植株

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 甘蔗总DNA的微量提取

2.2 转化植株的PCR检测

2.3 Southern Blot检测

2.4 转基因植株的RT-PCR检测结果

2.5 凝血活性测定实验数据及SAS分析结果

2.6 转基因植株的Bt-Cry1Ab/Ac免疫检测试纸条的检测

3 讨论

3.1 关于PPT筛选

3.2 关于甘蔗DNA微量提取

4 小结

5 本实验研究的后续工作

附录

1 培养基及常用抗生素的配制

1.1 培养基配制

1.2 抗生素及激素的配制

2 实验仪器

3 英文缩写符号及中英文对照表

参考文献

攻读博士期间发表论文情况:

致谢