巴西橡胶树蔗糖转运蛋白基因HbSUT5的表达特性研究

摘要

巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)的产胶功能是在一种特化的乳管系统中完成,蔗糖是天然橡胶生物合成的原料,需经长距离运输才能到达生产上的采胶部位,即茎干树皮的韧皮部乳管。由于乳管细胞与其周围细胞间缺少胞间连丝,蔗糖进入乳管系统需要通过一个跨膜运输。在高等植物中,已明确蔗糖转运蛋白(Sucrose transporter,SUT)介导蔗糖跨膜运输,在光合产物同化碳分配中起关键调控作用。电生理学实验发现,蔗糖是依靠H+-ATPase提供的质子经乳管原生质体膜进入乳管,表明在乳管细胞质膜上很可能存在质子-蔗糖共转运载体,即SUT。因此,研究SUT基因在橡胶树特别是乳管蔗糖供给中的表达调控特性,不仅有助于全面了解植物SUT家族基因的功能和进化特点,还有利于了解橡胶树中光合产物同化碳库组织的分配机制,特别是有助于阐明乳管蔗糖供给的分子调控,因此是一个既有理论研究价值又有实践应用前景的研究课题。
　　 我们在前期研究中发现,HbSUT5基因在胶乳中的表达不受乙烯利诱导,而受割胶和伤害处理下调,这种表达模式与决定乳管蔗糖供给和橡胶产量的关键基因HbSUT3明显不同。因此,本文开展对HbSUT5基因表达调控特点和生理学功能的研究。主要研究
　　 结果如下:
　　 1.利用酵母表达体系证明HbSUT5基因编码有功能的蔗糖转运蛋白,并属于高亲和、低转运能力的蔗糖转运蛋白;
　　 2.HbSUT5基因在胶乳、树皮和树叶中均高丰度表达,在叶片发育早期表达量最高,随叶片发育进程表达丰度下降;割胶和伤害可调控胶乳产量,在未开割树中,随着割胶次数的增加和伤害处理时间的延长HbSUT5基因的表达量逐渐降低,这种表达模式HbSUT3基因相反;甲基茉莉酸和水杨酸处理也可调控该基因的表达;
　　 3.HbSUT3基因系单拷贝或低拷贝基因,其启动子序列包含有真核生物典型的核心启动子区域和一些顺式作用元件,包括荣莉酸应答元件CGTCA-motif,生长素应答元件TGA-element,水杨酸应答元件TCA-element,抗性和胁迫应答相关TC重复序列,以及与分生组织表达相关的元件CAT-box等;原生质体瞬时表达研究表明该启动子序列可以启动报告基因GFP在烟草叶片中表达;
　　 4.利用荧光定量PCR技术,我们对23个候选橡胶树内参基因进行了筛选,确定在8种不同实验条件下适宜做基因表达分析的内参基因:研究割胶对基因表达的影响时,elF-1和MPD1是适宜的内参基因;在乙烯利处理的样品中,可以用UBC2和MPD2作为内参基因;JA处理的样品可以用UBC2和DRH2作为内参基因;SA处理的样品可以用Ef-2和MPD2作为内参基因;在研究同一品系不同单株胶乳基因表达时,可以使用UBC2和PP作为内参基因;在研究不同品系样品胶乳基因表达时,可以使用UBC2和UBC3作为内参基因;在研究不同组织材料间基因表达差异时,需要至少5个内参基因;在研究基因在叶片不同发育阶段时,18S-rRNA和Act4是适宜内参基因。
　　 综合以上结果,即割胶、伤害和一些激素处理对HbSUT5基因表达的影响,HbSUT家族基因表达的组织和叶片发育阶段特性,以及HbSUT5基因启动子的元件分析,我们初步认为HbSUT5基因可能参与对乳管蔗糖供给的调控,在多种组织,特别是在幼嫩组织发育的碳源供给上起作用。
　　 本文研究结果,为进一步阐明HbSUT5基因的表达调控特点和生理功能奠定了良好基础;此外,首次系统筛选了适于不同情况下橡胶树基因表达分析的适宜内参基因,对橡胶树分子生物学研究是一个有益贡献。

目录

文摘

英文文摘

1 前言

1.1 天然橡胶生产所面临的现状

1.2 橡胶树形态及生理学

1.3 橡胶树分子生物学研究现状

1.3.1 巴西橡胶树橡胶生物合成途径

1.3.2 橡胶生物合成相关基因的克隆及其表达调控

1.3.3 乳管分子生物学

1.4 高等植物蔗糖转运蛋白的研究进展

1.4.1 植物蔗糖转运蛋白基因的克隆

1.4.2 植物蔗糖转运蛋白的分类

1.4.3 植物蔗糖转运蛋白基因的功能

1.4.4 巴西橡胶树蔗糖转运蛋白研究现状

1.5 基因表达的定量分析方法

1.5.1 RNA印迹

1.5.2 核糖核酸酶保护分析

1.5.3 实时荧光定量PCR

1.5.4 cDNA微阵列技术

1.5.5 蛋白质印迹

1.6 定量分析中内参基因的选用

1.7 本研究的目的和意义

1.8 技术路线

2 材料和方法

2.1 材料与试剂

2.1.1 植物材料

2.1.2 载体及菌株

2.1.3 生化试剂

2.1.4 委托业务

2.2 方法与步骤

2.2.1 酵母体内C14标记的蔗糖吸收实验

2.2.2 反向Northern分析HbSUT基因的组织特异性表达

2.2.3 实时荧光定量PCR分析HbSUT5基因的表达

2.2.4 HbSUT4和HbSUT5基因的Southern杂交分析

2.2.5 橡胶树蔗糖转运蛋白基因HbSUT5启动子克隆及功能分析

2.2.6 实时荧光定量PCR技术筛选内参基因

3 结果与分析

3.1 酵母体内C14标记的蔗糖吸收实验

3.2 巴西橡胶树不同组织总RNA的提取

3.3 反向Northern分析蔗糖转运蛋白基因的组织特异性表达

3.4 荧光定量PCR分析HbSUT5基因的表达

3.4.1 割胶对HbSUT5基因表达的影响

3.4.2 伤害对HbSUT5基因表达的影响

3.4.3 叶片发育不同时期HbSUT5基因表达变化

3.4.4 不同激素处理对HbSUT5基因表达的影响

3.5 叶片DNA的提取

3.6 Southern杂交分析HbSUT4和HbSUT5基因在基因组中的拷贝数

3.6.1 探针的制备

3.6.2 基因组DNA的酶切

3.6.3 Southern杂交分析

3.7 HbSUT5基因启动子序列的分离与功能分析

3.7.1 HbSUT5基因启动子序列的分离

3.7.2 HbSUT5基因的启动子序列分析

3.7.3 HbSUT5基因的启动子瞬时表达功能分析

3.8 荧光定量PCR筛选内参基因

3.8.1 候选内参基因引物特异性检测及其扩增效率

3.8.2 各种不同实验条件下的内参基因筛选

4 讨论

4.1 关于HbSUT5基因的功能

4.2 关于基因启动子的克隆方法

4.3 关于基因表达分析中内参基因的选择

5 结论

参考文献

附录

附录一:有关试剂的配制

附录二:缩略词

致谢

硕士期间发表的文章