LukS-PV对人髓细胞白血病HL-60的细胞周期阻滞及凋亡的影响

摘要

目的：PV-杀白细胞毒素(PVL，Panton-Valetine leukocidin)是金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus,金葡菌)分泌的一种双组分白细胞毒素，可以特异性杀伤人和兔PMNs（polymorphonuclear leukocytes）导致PVL相关肺损伤的发生。LukS-PV是PVL的双组份之一，本课题前期研究发现重组LukS-PV蛋白(rLukS-PV)具有抑制急性髓细胞白血病(AML)细胞株HL-60增殖的作用，但其机制尚不清楚。本课题在体外表达并纯化获得rLukS-PV，研究rLukS-PV对HL-60的细胞凋亡和细胞周期的影响，并探讨其凋亡机制。
　　方法：⑴体外培养HL-60细胞，分别加入0.05，0.25，0.50，0.75，1.00μmol/L rLukS-PV蛋白，共同孵育3，6，9，12h，MTS法检测rLukS-PV对HL-60细胞增殖抑制率。⑵体外培养HL-60细胞，分别加入0.05，0.50，1.00μmol/L rLukS-PV作用HL-60细胞12h，台盼兰染色观察细胞活力；流式细胞术和TUNEL检测HL-60细胞凋亡率、坏死率；流式细胞术检测细胞周期各时期分布；Western blot检测细胞周期调控蛋白cyclin A和 cyclin D1表达。⑶体外培养HL-60细胞，加入1.00μmol/L rLukS-PV蛋白，共同孵育12h，Western blot检测细胞凋亡通路有关蛋白的表达，包括TNF、FAS、caspase-9、caspase-3、caspase-8、Bax和Bcl-2。
　　结果：①随着rLukS-PV对HL-60细胞作用浓度的增加，台盼兰染色着色细胞逐渐增多，细胞活力进行性下降。②rLukS-PV处理组中HL-60细胞的增殖抑制率明显增高，且增殖抑制作用呈时间及剂量依赖性关系。③rLukS-PV促进HL-60细胞的凋亡，且凋亡作用呈剂量依赖性关系。④rLukS-PV处理组将HL-60细胞阻滞在S期，且细胞周期调控蛋白cyclin A呈剂量和时间依赖性降低，cyclin D1无明显变化。⑤Western blotting结果显示rLukS-PV作用HL-60细胞，caspase-8、caspase-9、caspase-3、Bax表达升高，Bcl-2表达降低；而TNF和FAS不表达。
　　结论：⑴rLukS-PV对HL-60细胞具有明显的抑制生长增殖作用，这种抑制生长增殖作用呈时间和剂量依赖性关系。⑵随着rLukS-PV浓度的增加，细胞的活力明显减低。⑶rLukS-PV可诱导HL-60细胞凋亡，且凋亡率呈剂量依赖性上升；可将HL-60细胞阻滞在S期，且细胞周期调控蛋白cyclin A表达呈剂量和时间依赖性下降。⑷rLukS-PV能促进HL-60细胞的凋亡通路中caspase-9、caspase-3、Bax的表达，同时，可下调Bcl-2的表达，提示rLukS-PV可通过线粒体凋亡的信号传导通路促进HL-60细胞的凋亡。

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第一章 前 言

第二章 材料和方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

第三章 结果

3.1 HL-60细胞活力观察

3.2 rLukS-PV对HL-60细胞抑制增殖率的测定

3.3 HL-60细胞凋亡和坏死率测定

3.5 HL-60细胞周期分布及相关细胞周期调控蛋白的测定

3.6 Western blotting 检测TNF、Bcl-2和Caspase家族相关的蛋白表达

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

致谢

附录A英文缩略词表

附录B部分试剂的配置

附录C个人简历

附录D攻读硕士学位期间发表文章

附录E 综述: 急性髓细胞白血病靶向治疗进展