变形链球菌乳酸脱氢酶与霍乱毒素B亚单位嵌合表达质粒的构建及转化烟草研究

摘要

龋病是人类最常见的细菌感染性疾病之一，严重影响着人类健康。变形链球菌(简称变链菌)是人类龋病的主要致病菌。免疫防龋是控制龋病的有效手段之一。近年来，利用转基因植物技术生产可食疫苗的研究日益发展。转基因植物疫苗能够通过直接口服的给药方式诱导动物和人体的粘膜和系统免疫应答，具有安全、有效、廉价和方便等优点，日益显示出其广阔的应用前景和潜在的经济效益。 目的：构建含变链菌乳酸脱氢酶编码基因ldh和粘膜免疫佐剂霍乱毒素B亚单位编码基因ctxB嵌合基因的原核质粒，并转化E.coliBL21(DE3)经IPTG诱导表达融合蛋白；构建该嵌合基因的植物表达载体并以根癌农杆菌介导法转化烟草，获得转基因烟草，为下一步利用转基因植物技术生产可食防龋疫苗的研究打下基础。 方法：本研究共分两部分： 1．变链菌乳酸脱氢酶和霍乱毒素B亚单位嵌合基因表达质粒的构建及表达通过基因重组技术构建携带有变链菌乳酸脱氢酶编码基因ldh及霍乱毒素B亚单位编码基因ctxB的嵌合基因原核表达质粒并经IPTG诱导表达融合蛋白。此部分包括5项内容：①提取变链菌基因组DNA为模板，设计合成引物扩增LDH编码基因ldh；②目的基因和载体pET32a(+)分别以限制性内切酶KpnⅠ和SacⅠ双酶切后连接，构建质粒pET-ldh；③以pBSK-ctxB为模板，设计引物扩增目的基因片段ctxB；④片段ctxB和质粒pET-1dh分别以SacⅠ和XhoⅠ双酶切后连接，构建重组质粒pET-1dh-ctxB，并经酶切、PCR和插入序列测序分析鉴定。⑤重组质粒pET-1dh-ctxB转化E.co1iBL21(DE3)，经IPTG诱导表达融合蛋白。 2.构建变链菌乳酸脱氢酶编码基因ldh和霍乱毒素B亚单位编码基因ctxB的嵌合基因植物表达载体及转化烟草，获得转基因烟草植株。 此部分包括4项内容：①以质粒pET-1dh-ctxB为模板，设计引物PCR扩增嵌合基因；②植物中间表达载体p2355和嵌合基因分别以XbaI和KpnI双酶切后连接，构建植物表达载体p2355-1dh-ctxB，并经电击法导入根癌农杆菌EHA105中；③以根癌农杆菌叶盘转化法，通过农杆菌与烟草外植体共培养、分化选择培养(含卡那霉素100mg/L)将嵌合基因导入烟草，获得烟草转嵌合基因抗性植株；④抗性植株的检测。根据nptⅡ和目的基因序列设计引物，进行PCR扩增检测nptⅡ基因和目的基因及GUS组织染色筛选鉴定，通过RT-PCR检测嵌合基因是否有mRNA的表达。 结果：①构建的原核质粒pET-1dh-ctxB，经KpnⅠ、XhoⅠ双酶切及目的基因PCR检测，均得到大小约1.4kb的片段，与预期目的基因大小相同。②插入基因序列测序及比对结果显示，质粒pET-1dh-ctxB中的ldh与GeneBank中ldh同源性98％，ctxB与GeneBank中ctxB同源性99％，插入的相位正确，提示嵌合基因ldh-ctxB已正确插入载体pET32a(+)中。③通过SDS-PAGE电泳分析可知，经IPTG诱导后，质粒pET-ldh-ctxB表达蛋白约70KD与预期大小相符，pET32a(+)表达蛋白分子量约20KD，提示成功表达了ldh-ctxB的融合蛋白。④构建的植物表达载体p2355-1dh-ctxB，经XbaⅠ、XpnⅠ双酶切及目的基因PCR检测均能得到大小约1.4kb的片段，与预期目的基因大小相同，插入相位正确，提示嵌合基因ldh-ctxB已正确插入载体p2355中。⑤携带植物表达载体p2355-1dh-ctxB根癌农杆菌EHA105介导转化烟草得到的抗性植株GUS组织染色呈强阳性，提取GUS染色阳性的抗性植株总DNA，PCR扩增nptⅡ基因片段和目的基因部分片段，均获得了与预计大小相同的基因片段；随机选择部分阳性植株提取总RNA进行RT-PCR，部分样品能扩增出与ldh-ctxB基因部分片段一致的电泳条带，表明获得了转基因烟草，嵌合基因已成功导入烟草基因组中且有mRNA表达。 结论：成功构建了变链菌乳酸脱氢酶编码基因和粘膜免疫佐剂霍乱毒素B亚单位编码基因的嵌合质粒pET-ldh-ctxB，并能正确表达融合蛋白；成功构建了嵌合基因植物表达质粒p2355-1dh-ctxB，经根癌农杆菌介导转化烟草后获得了转基因烟草植株。

目录

主要英文缩略词

摘要

前言

第一部分 变链菌乳酸脱氢酶与霍乱毒素B亚单位嵌合表达的构建及原核表达

第二部分 变链菌乳酸脱氢酶与霍乱毒素B亚单位嵌合基因植物表达载体的构建及转化烟草研究

全文总结

参考文献

文献综述 转基因植物的生态安全性

致谢