苍耳子提取物抗乙型肝炎病毒实验研究

摘要

[目的]：通过体外细胞培养和雏鸭体内试验，探讨不同浓度的苍耳子提取物对HBV的影响。 [方法]：体外实验选用HBVDNA转染的HepG22.2.15细胞，分别加入含有苍耳子提取物10mg/ml、1mg/ml、0.1mg/ml、0.01mg/ml、0.001mg/ml的培养液，作用2d、4d、6d，采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法筛选出苍耳子提取物无毒浓度，再以免疫荧光法、流式细胞术(FCM)、放射免疫定量法(IRMA)及荧光定量PCR等方法，检测不同时间药物对细胞分泌的HBsAg、HBeAg、HBcAg及HBVDNA的影响。同时以3TC(50μg/ml)、IFN-α(1000U/ml)组作为阳性药物的无毒浓度组，不加药组作细胞病毒对照。体内实验以鸭乙型肝炎病毒(DHBV)DNA阳性雏鸭作动物模型，分别给予1mg·kg-1·d-1、0.1mg·kg-1·-1、0.01mg·kg-1·d-1的苍耳子提取物，每天1次，连续给药10d。定期采血，检测用药前后血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的变化，用斑点杂交试验检测药物对鸭血清中DHBVDNA的影响，并取鸭肝作HE染色，观察组织学变化；阳性对照药给以3TC(2mg·kg-1·d-1)；病毒模型对照组和空白对照组(DHBVDNA阴性的雏鸭)，给予同体积的三蒸水。 [结果]：(1)体外试验：①用MTT法检测药物对2.2.15细胞的毒性作用，苍耳子提取物毒性呈浓度依赖性，其中10mg/ml、1mg/ml浓度组分别在第2d及第6d出现对2.2.15细胞的毒性作用(P＜0.05)；0.1mg/ml浓度以下实验组，6d内对2.2.15细胞生长无毒性作用(P＞0.05)；3TC随着浓度增加对2.2.15细胞的毒性亦增加，50μg/ml浓度组6d内未见明显细胞毒性(P＞0.05)；IFN-α各组在6d内，未见细胞生长抑制现象(P＞0.05)。②用流式细胞术、放射免疫法检测药物对2.2.15细胞分泌的HBsAg、HBeAg及HBcAg的作用，苍耳子提取物(0.1～0.001mg/ml)组对HBsAg有抑制作用(P＜0.05)，其中0.1mg/ml组对HBsAg的抑制作用优于3TC50μg/ml组(P＜0.05)；该浓度对HBeAg有抑制作用(P＜0.05)，但不优于两种阳性药；0.01～0.001mg/ml组对HBeAg无抑制作用；三种浓度苍耳子提取物对HBcAg均无抑制作用；3TC50μg/ml组对HBsAg、HBcAg均有显著抑制作用(P＜0.05)，其毒性呈时间依赖性，对HBeAg有显著抑制作用(P＜0.01)；IFN-α1000U/ml组对HBsAg的抑制作用更明显(P＜0.01)，随培养天数增加，抑制率逐渐增加，至第6d时，抑制率达71.29％，对HBeAg、HBcAg有抑制作用(P＜0.05)；两种阳性药物比较，IFN-α1000U/ml组对HBsAg、HBcAg的抑制作用优于3TC50μg/ml组(P＜0.05)，在同一时间内IFN-α1000U/ml对HBeAg的抑制作用与3TC50μg/ml组无差异(P＞0.05)。③用荧光定量PCR法检测HBVDNA，三种浓度的苍耳子提取物可降低HBVDNA拷贝数，但无统计学意义(P＞0.05)。3TC50μg/ml组对HBVDNA有显著抑制作用(P＜0.05)，IFN-α1000U/ml抑制作用更明显(P＜0.01)。(2)体内实验：①用赖氏比色法对ALT和AST进行检测，空白对照组和病毒模型对照组在实验期间ALT和AST结果稳定，组间无差异(P＞0.05)；用药期间与模型对照组比较，苍耳子提取物各浓度组ALT及AST水平无显著性差异(P＞0.05)，表明该药未对肝功能造成损害；阳性药物对照组3TC(2mg·kg-1·d-1)在用药第10d后，ALT升高，与同时期病毒模型组比较有差异(P＜0.05)，提示该浓度3TC对肝脏可能有一定的毒性。②鸭肝病理切片观察可见，DHBVDNA阳性鸭肝细胞出现明显空泡变性，胞浆疏松，汇管区可见炎细胞浸润，有点状出血、坏死；随着苍耳子提取物浓度增高，肝细胞病变程度逐渐减轻，苍耳子提取物(1g·kg-1·d-1)治疗的鸭肝细胞水肿程度明显轻于病毒模型对照组；3TC组鸭肝细胞形态正常。③用斑点杂交试验检测鸭血清中的DHBVDNA，苍耳子提取物各组治疗5d(T5)、治疗10d(T10)与治疗0d(T0)比较，对DHBVDNA无抑制作用(P＞0.05)；阳性药物3TC组，DHBVDNA量明显减少(P＜0.05)，而停药3d(P3)DHBVDNA明显反弹(P＜0.05)。 [结论]：苍耳子提取物体外实验可抑制2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg，但对HBcAg、HBVDNA无抑制作用，在体内实验中，对鸭肝的病理改变有延缓作用，不影响转氨酶水平，不能降低鸭血清中DHBVDNA。

目录

英文缩略词表

摘要

前 言

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

参考文献

综述 乙型肝炎的抗病毒药物治疗

致谢