薄层色谱生物自显影新方法的建立及荷叶碱衍生物抗乙酰胆碱酯酶活性评价

摘要

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)，是一种多发于老年人，以进行性认知障碍和记忆能力损害为主的中枢神经系统退行性疾病。目前为止，对于AD发病机理主要以胆碱能假说和β-淀粉样蛋白学说为主。根据学说，抑制AD病人乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase，AChE)的活力，延长脑内乙酰胆碱的存在时间，使乙酰胆碱在脑内的含量增加，成为当前治疗AD有效的手段之一。因此，乙酰胆碱酯酶抑制剂(Acetylcholinesterase inhibitor，AChEI)被广泛的应用于AD的治疗，并取得一定效果。但现在的治疗药物只能延缓AD患者的病情加深，不能完全治愈，并且还存在药物具有副作用、活性不高、选择性低等方面的不足。为了寻找新的更高效的AChEI，本论文进行了以下的两方面研究。
　　 其一，用于检测植物提取物中乙酰胆碱酯酶抑制剂的薄层色谱生物自显影新方法的建立迄今为止，薄层色谱(TLC)生物自显影技术和Ellman方法是检测AChEI较常用的实验方法。前者优势在于可以同时从植物提取物中检测并分离有AChE抑制活性的化合物。而后者主要针对实验室合成的或分离得到的天然的化合物进行准确的测定。但现有的TLC自显影方法酶消耗量大(6U/mL)，实验成本较高，从而阻碍了经费不足的实验中心的研究工作。因此，建立一种酶的用量低、检测线低的新型TLC生物自显影方法，是非常必要的。
　　 本文首先利用乙酰化的方法，合成了22种新的乙酰胆碱酯酶底物（乙酸酯衍生物），然后利用HPLC技术对于每个化合物的酶水解情况进行测定，筛选得到了5种酶水解效果较好的底物（水解率＞50％）接着分别以重氮化联苯胺、重氮化-4-硝基苯胺、铁氰化钾-氯化铁和羟基胺-氯化铁为显色剂，来构建新的薄层色谱生物自显影技术。结果显示只有以4-甲氧基醋酸苯酯(14)作为底物，铁氰化钾和七水合氯化铁混合溶液做为显色剂时，成功建立了新型薄层色谱生物自显影方法。该方法中酶的消耗量大大降低(1U/mL)，两种阳性药石杉碱甲和毒扁豆碱的检测线也较低（分别为0.1ng和1ng）。
　　 新方法的优点在于不但降低酶的用量，而且背景与抑制剂斑点反差较大，容易观察，使得寻找新型AChEI更加便捷。
　　 其二，荷叶碱衍生物的合成及抗乙酰胆碱酯酶活性评价。
　　 本研究小组在前期研究工作中，从荷叶中发现了一个荷叶碱衍生物（2-羟基-1-甲氧基阿朴啡，2-hydroxy-1-methoxyaporphine，化合物34），其具有高的乙酰胆碱酯酶抑制活性(IC50=1.5μg/mL)。本文对荷叶碱(Nuciferine)进行了结构修饰，并研究了其构效关系，具体如下：
　　 (1)以荷叶碱为原料，通过O-脱烷基化、N-脱烷基化和芳构化等反应，合成出8种荷叶碱衍生物，它们分别是1-羟基-2-甲氧基阿朴啡(24)、1，2-二羟基阿朴啡(25)、6-羟基去氢荷叶碱(26)、荷叶碱-N-氧化物(27)、去氢荷叶碱(28)、原荷叶碱(29)、1-羟基-2-甲氧基-N-降阿朴啡(30)和1，2-二羟基-N-降阿朴啡(31)。
　　 (2)利用改进的Ellman方法，对各化合物在终浓度为0.1mg/mL的条件下，进行活性测定。结果表明1，2-二羟基阿朴啡(25)和去氢荷叶碱(28)具有中等AChE抑制活性，IC50分别为28μg/mL和25μg/mL。
　　 (3)比较构效关系后发现荷叶碱的C环芳构化及C-1烷氧基、C-2位羟基、氮上烷基取代基的变化对化合物活性影响较大。
　　 以上研究，为今后由荷叶碱合成更高活性的乙酰胆碱酯酶抑制剂奠定基础。

目录

文摘

英文文摘

第1章 绪论

1.1 引言

1.2 AD发病机理

1.2.1 β-淀粉样蛋白学说（Aβ学说）

1.2.2 胆碱能假说

1.2.3 Tau蛋白假说

1.2.4 炎症学说

1.2.5 氧化应激学说

1.3 乙酰胆碱酯酶的分子结构及活性中心

1.4 乙酰胆碱酯酶抑制剂及其构效关系

1.4.1 他克林（Tacrine）

1.4.2 多奈哌齐（Donepezil）

1.4.3 利斯的明（Rivastigrnine）

1.4.4 加兰他敏（Galantamine）

1.4.5 石杉碱甲（Huperzine A）

1.5 乙酰胆碱酯酶活性测定方法

1.5.1 薄层色谱生物自显影方法

1.5.2 Ellman法

1.6 小结

1.7 课题来源及研究内容

1.8 课题目的及意义

1.8.1 研究目的

1.8.2 研究意义

第2章 新型薄层色谱生物自显影方法的建立

2.1 材料与仪器

2.1.1 试剂和药材

2.1.2 仪器

2.2 实验方法

2.2.1 酯的合成

2.2.2 AChE水解合成底物能力的评价

2.2.3 TLC生物自显影实验

2.2.4 假阳性排除实验

2.2.5 黄柏总生物碱的提取

2.3 结果与讨论

2.4 小结

2.5 化合物的理化数据

第3章 荷叶碱衍生物的合成及乙酰胆碱酯酶抑制活性评价

3.1 材料与仪器

3.1.1 材料和药品

3.1.2 仪器

3.2 实验方法

3.2.1 荷叶碱的提取分离

3.2.2 化合物24-31的合成

3.2.3 衍生物对乙酰胆碱酯酶抑制活性测定

3.3 结果与讨论

3.3.1 化学合成

3.3.2 生物活性及构效关系分析

3.3 小结

参考文献

致谢

附录A （攻读硕士期间发表的论文）

附录B 化合物24-31的1H-NMR谱