淫羊藿苷促进成骨细胞成熟矿化的分子机理研究

摘要

骨质疏松症（OP）是一种骨量减少、骨密度降低、骨微结构退化以致骨脆性增加的全身性骨骼疾病，是全球四大非传染性致死疾病之一。目前治疗骨质疏松症的主要药物有雌激素类药物和双磷酸盐类药物等，均存在副作用大、价格昂贵等缺陷，因而越来越多的研究者开始寻找骨质疏松症的替代疗法。淫羊藿苷作为一种从中草药淫羊藿中提取的黄酮苷类化合物，具有促进成骨细胞成熟矿化、抑制破骨细胞骨吸收、提高青年大鼠峰值骨量等活性，是治疗绝经后骨质疏松症的潜在药物之一。然而，目前对于淫羊藿苷促进骨形成的分子机制一直不明确，淫羊藿苷将作为临床药物被用于治疗和预防骨质疏松症也因此备受质疑。初级纤毛作为哺乳动物细胞表面的特殊细胞器，其内部含有多种信号通路的受体及下游蛋白，可以作为药物的新靶点。研究表明，初级纤毛在骨代谢相关的信号转导过程中发挥着重要作用，鉴于上述研究，本文研究了淫羊藿苷促进骨形成与初级纤毛及其下游信号转导途径的关系。
　　首先，将体外分离培养的新生大鼠成骨细胞进行免疫荧光染色，检测其初级纤毛的发生率；用RNA干扰抑制IFT88的表达进而敲除初级纤毛，淫羊藿苷作用于无纤毛的成骨细胞后，检测胞内成骨性因子的表达，包括碱性磷酸酶（ALP）的活性，COL1、RUNX-2基因和蛋白的表达以及形成钙化结节的能力，判断淫羊藿苷促进成骨细胞成熟矿化的能力是否受到抑制。结果表明，成骨细胞表面具有长约8μ的初级纤毛，具有初级纤毛的细胞占总细胞数的75％以上。RNA干扰法敲除成骨细胞表面的初级纤毛后，淫羊藿苷促进成骨细胞成熟矿化的能力被显著抑制。
　　其次，淫羊藿苷作用于正常成骨细胞不同时间后，ELISA检测胞内第二信使 cAMP的含量，免疫荧光染色检测蛋白激酶 A（PKA）催化亚基α核转位情况，用腺苷酸环化酶（AC）的阻断剂2’,3’-双脱氧腺苷（DDA）和蛋白激酶 A（PKA）的阻断剂 KT5720对 cAMP-PKA信号通路进行阻断后，检测淫羊藿苷促进成骨相关因子表达的能力是否受到抑制。结果表明，淫羊藿苷作用于成骨细胞不同时间后，胞内cAMP的含量迅速增加，并引起胞内PKA催化亚基α发生核转位，预示淫羊藿苷促进骨形成可能与 cAMP-PKA信号通路相关。利用AC和PKA抑制剂对cAMP-PKA信号通路进行阻断后，淫羊藿苷促进成骨细胞成熟矿化的能力被抑制。
　　最后，利用RNA干扰法敲除初级纤毛后，ELISA检测胞内cAMP的含量。免疫荧光法检测腺苷酸环化酶6（AC6）在胞内的定位情况，RNA干扰法抑制AC6的表达后，检测淫羊藿苷促进成骨相关因子表达的能力是否受到抑制。结果表明，去除成骨细胞表面初级纤毛后，淫羊藿苷促进胞内 cAMP含量升高的能力消失，免疫荧光染色发现，腺苷酸环化酶6（AC6）定位于初级纤毛中。用RNA干扰法抑制胞内 AC6表达后，淫羊藿苷促进骨形成的能力同样被抑制。
　　综上所述，本研究证明淫羊藿促进成骨细胞成熟分化依赖于初级纤毛及初级纤毛相关的cAMP-PKA信号通路。

目录

封面

声明

目录

英文缩写词表

中文摘要

英文摘要

第一章 绪论

1 淫羊藿苷预防和治疗骨质疏松症的研究现状

2初级纤毛的结构与功能

3 cAMP-PKA信号通路与骨形成的关系

4 本课题的研究内容及意义

第2章 淫羊藿苷促进成骨细胞成熟矿化依赖于初级纤毛

1 材料和方法

2 方法

3 结果

4 讨论

第3章 淫羊藿苷促进成骨细胞成熟矿化依赖于cAMP-PKA信号通路

1 材料与仪器

2 方法

3 结果

4 讨论

第4章 淫羊藿苷促进骨形成依赖于定位于初级纤毛的腺苷酸环化酶6（AC6）

1 材料与方法

2 方法

3 结果

4 讨论

结论

参考文献

致谢

附录A：攻读学位期间所发表的学术论文目录