基于酵母双杂交系统ABI5保守区Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的相互作用性研究

摘要

拟南芥ABI5家族有9个成员，对这些成员进行蛋白多序列比对时发现有7个保守区，其中保守区II（CRII）在酵母细胞中激活转录。当保守区I（CRI）、保守区II（CRII）、保守区III（CRIII）分别一起存在时，CRII的转录激活作用被抑制。据此，本论文以ABI5家族中最小成员-AtDPBF4的序列为模板，构建了编码AtDPBF4的CRI、CRII、CRIII三个保守区的重组质粒，以期通过酵母双杂交系统了解CRI、CRIII与CRII之间是否存在相互作用，深入探讨CRI和CRIII抑制CRII活性的机制。
　　本论文的研究结果如下：
　　1.对AtDPBF4基因序列编码的氨基酸序列的理化性质、疏水性、磷酸化位点、保守序列、高级结构、系统进化树进行了生物信息学分析。ProtParam分析结果显示该序列的总分子量为29.19 kD，氨基酸数目为262，理论等电点为8.89。ExPASy中的ProtScale进行该蛋白序列的疏水性分析，结果显示序列中第145位谷氨酰胺疏水性最弱，疏水指数为-2.978，第117位丙氨酸疏水性最强，疏水指数为1.778。NetPhos2.0磷酸化位点分析表明该序列可能含有11个磷酸化位点。SSPro4.0二级结构分析表明该蛋白由14个α-螺旋、6个β-折叠、1个β-转角和10个无规卷曲组成。SMART软件结构域分析显示在188-260氨基酸之间是一个碱性亮氨酸拉链（basic region leucinzipper,BRLZ）结构域。NCBI CDD分析显示该序列在192-237之间是一个bZIP保守结构域。MEGA6.05对AtDPBF4在NCBI数据库中同源性大于95％的蛋白质序列构建系统进化树，显示该基因属于ABI5家族。
　　2.依照AtDPBF4的氨基酸序列化学合成了CRI、CRII和CRIII片段，分别克隆至pGBKT7和pGADT7中。限制性内切酶EcoRI和BamHI对质粒载体pGBKT7、pGADT7和三个保守区片段进行限制性双酶切。CRI和CRIII片段分别克隆进pGBKT7质粒。由于CRII具有转录激活活性，因此，CRII被克隆进pGADT7载体。重组克隆经核苷酸序列分析核实，最终获得重组载体pGBKT7-CRI-1、pGBKT7-CRIII-3和pGADT7-CRII-4。酵母双杂交实验选用酵母菌Y187作为实验菌株，将三个重组质粒分成两个组合（组合1：pGBKT7-CRI-1+pGADT7-CRII-4；组合2：pGBKT7-CRIII-3+pGADT7-CRII-4）分别进行酵母感受态细胞转化。X-Gal作为显色剂检测双杂交结果。结果表明：在6h的显色实验中，两组的显色结果均为白色。据此，保守区I、III与保守区II之间可能没有相互作用。

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英文缩略词表

第一章 绪 论

1.1脱落酸的信号转导概述

1.2 ABA信号转导途径

1.3 ABI5家族及保守区分析

1.4 酵母双杂交系统

第二章 研究目的和技术路线

2.1 研究目的

2.2 研究技术路线

第三章AtDPBF4基因序列生物信息学分析

3.1 分析方法

3.2结果与分析

第四章 AtDPBF4保守区I、II、III的重组质粒构建

4.1 材料与试剂设备

4.2实验方法

4.3 结果与分析

第五章 重组质粒的酵母双杂交分析

5.1 实验材料

5.2酵母双杂交所需培养基和试剂配制

5.3酵母双杂交显色试剂

5.4实验设备

5.5实验方法

5.6 结果与分析

结论

参考文献

致谢

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