心肌梗死后hRAMP1修饰MSCs移植对球囊损伤血管再狭窄及心功能影响的研究

摘要

目的和背景：
　　 冠状动脉介入治疗(PCI)中由于球囊扩张或支架植入造成血管损伤等而引起的术后血管再狭窄,一直是临床上急待解决的重要课题。MSCs移植治疗不仅可以改善心肌梗死后心功能,而且也具有一定的促进损伤动脉内皮修复和抑制新生内膜增生的作用。但单纯MSCs移植这种有益的作用不足对抗由于球囊扩张或支架植入引起的内皮损伤和内膜反应性增生。我们既往研究显示,MSCs在促进损伤动脉内皮修复同时,对抑制平滑肌增殖的作用相对较弱。因此,如何通过相关基因修饰或改造MSCs,使其在最大效应发挥在心肌、内皮保护有益作用的基础上,加强对VSMCs增殖及血管内膜增生的抑制潜能,是下一步研究必须关注的重点方向。近来研究发现,降钙素基因相关肽(CGRP)及其受体亚单位(RAMP1)在体内外均有抑制VSMCs增殖和促进细胞凋亡的作用,而RAMP1是调节CGRP受体作用最为关键的信号肽,外源RAMP1基因的导入可能增强其抗增殖作用。因此,本研究依据临床上心肌梗死后的PCI治疗模式,以兔为研究对象,建立心肌梗死再灌注并颈动脉球囊损伤的双损伤模型,通过构建高表达hRAMP1基因的MSCs(hRAMP1-MSCs),同步平行观察hRAMP1-MSCs移植对兔心肌梗死后心脏功能和损伤血管再狭窄的双重影响,探讨hRAMP1基因在发挥MSCs对心肌梗死后心功能和内皮保护的同时,是否对抑制血管平滑肌增殖产生更为有利的影响,以期为临床上PCI术后再狭窄的防治提供较为深入的动物实验依据。
　　 方法：
　　 第一部分:分离培养获得兔主动脉VSMCs,细胞同步化后腺病毒转染细胞2h后以AngⅡ刺激细胞增殖,实验分为Ad-EGFP-hRAMP1转染组(hRAMP1组)、Ad-EGFP转染组(空病毒组)和对照组,每组根据培养时间分为24h、48h、72h和96h4个亚组。应用免疫细胞化学染色检测hRAMP1蛋白的表达,细胞计数法和MTT比色实验检测VSMCs增殖活性,流式细胞术及TUNEL法检测VSMCs凋亡水平。
　　 第二部分:密度梯度离心结合贴壁法培养兔的MSCs,取第3～4代(P3～4)MSCs用于实验;建立兔心肌梗死再灌注并颈动脉球囊损伤双损伤模型(简称双模型),应用带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的hRAMP1重组腺病毒载体(Ad-EGFP-hRAMP1)和空病毒载体(Ad-EGFP)转染MSCs,72h后静脉注射至双模型兔,实验分为Ad-EGFP-hRAMP1-MSCs移植组(hRAMP1-MSCs组,n=24)、Ad-EGFP-MSCs移植组(MSCs组,n=24)和等体积的PBS液注射组(对照组,n=20)。分别于细胞移植后7d、14d和28d取心脏和血管组织用于相关指标测定:免疫荧光检测EGFP和CD31观察MSCs归巢和分化情况,RT-PCR和Westernblot检测hRAMP1表达;HE和Masson染色检测心肌组织形态学,TTC染色对心肌梗塞面积的测定;免疫细胞化学检测血管PCNA、α-SMA和TNF-α表达,TUNEL法检测细胞凋亡;ELISA法测定血浆CRP和TNF-α水平;动物处死前心脏超声检测心功能等。
　　 结果：
　　 第一部分:腺病毒转染细胞,随时间延长EGFP表达逐渐增加,72h表达最强,转染率达80％,96h仍有EGFP表达,但与72h比较之间无差异性。腺病毒转染后hRAMP1组VSMCs中hRAMP1蛋白表达明显增加,hRAMP1降低AngⅡ诱导VSMCs增殖,与空病毒组和对照组比较均有明显的差异性(P＜0.05);同时,hRAMP1组细胞凋亡率亦明显高于空病毒组和对照组(P＜0.05)。
　　 第二部分:(1)hRAMP1-MSCs组和MSCs组的损伤颈动脉内膜在各时间点均有EGFP标记的MSCs归巢,且血管增生内膜有连续性CD31表达,对照组则无CD31表达;细胞移植后28d行RT-PCR检测显示,hRAMP1-MSCs组心肌组织和损伤血管局部均有hRAMP1基因表达;Westernblot检测细胞移植后28d各组心肌组织和损伤血管也显示有hRAMP1基因表达,但hRAMP1-MSCs组较其它两组表达明显增加(P＜0.05),MSCs组与对照组之间比较无差异(P＞0.05)。与对照组比较,细胞移植后28d时hRAMP1-MSCs组和MSCs组心功能均得到改善、心肌梗死面积缩小,尤以hRAMP1-MSCs组显著。(2)细胞移植后7d、14d和28d,对照组内膜增生明显,细胞移植后增生内膜面积、新生内膜/中膜面积与对照组同时间点比较显著降低,尤以hRAMP1-MSCs移植组明显(P＜0.05);细胞移植后28d,各组颈动脉增生内膜细胞中均见α-SMA表达。(3)细胞移植后28dhRAMP1-MSCs组中PCNA和TNF-α表达率低于另外两组(P＜0.05),而MSCs组又明显低于对照组(P＜0.05);同时还观察到VSMCs凋亡率在hRAMP1-MSCs组最高,MSCs组次之,对照组凋亡率最低(P＜0.05)。细胞移植后1d和7d时ELISA法检测显示hRAMP1-MSCs组和MSCs组中血浆TNF-α和CRP的浓度较对照组明显降低(P＜0.05),尤以hRAMP1-MSCs组降低显著。14d和28d时对照组TNF-α水平仍高,但hRAMP1-MSCs组和MSCs组水平明显降低,尤以hRAMP1-MSCs组明显。细胞移植后14d,CRP水平逐渐降至正常水平,各组间差异无统计学意义。
　　 结论：
　　 第一部分:hRAMP1基因重组腺病毒载体转染VSMCs后明显抑制AngⅡ诱导细胞增殖,促进细胞凋亡,这可能成为某些血管增殖性疾病治疗的新靶点。
　　 第二部分:hRAMP1基因修饰MSCs较单纯MSCs移植在进一步改善梗死后心脏功能,促进损伤血管内皮修复同时,显示出更强地抑制VSMCs增殖和促进细胞凋亡的作用,并显著降低血管成形术后的炎症反应;重组hRAMP1腺病毒载体不影响MSCs向内皮细胞分化潜能,提示基因修饰后的干细胞治疗可能更有效地抑制内膜增生,从而降低血管成形术后再狭窄的发生。