神经生长因子及其受体在先天性肛门直肠畸形动物模型直肠末端的表达及意义

摘要

目的：通过检测肛门直肠畸形(ARM)动物模型直肠末端神经生长因子(NGF)及其受体(NGFR)TrkA、p75NTR的表达水平，了解ARM直肠末端肠神经系统(ENS)发育情况，探讨肛门直肠畸形术后患儿排便功能障碍的可能机制。
　　 方法：选用成年SD孕鼠16只，实验组10只，对照组6只，实验组孕鼠在孕11d、13d两次给予10g/L乙烯硫脲(ETU)(125mg/kg)灌胃制作ARM动物模型，对照组灌胃注入等量生理盐水。两组孕鼠在孕20d手术取出宫内胎鼠，大体形态学观察及畸形统计后取胎鼠盆腔会阴部矢状面大体标本行苏木素/伊红(HE)染色，计算两组直肠末端粘膜下和肌间神经丛数量；通过免疫组织化学方法(IHC)检测NGF及其受体TrkA、p75NTR在正常胎鼠和ARM胎鼠直肠末端的分布情况并做半定量分析；采用实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测正常胎鼠和ARM胎鼠直肠末端TrkA、p75NTR表达情况并做扩增产物电泳分析。
　　 结果：①大体形态学观察及畸形统计显示：对照组胎鼠存活率100％，肛门开口正常；实验组胎鼠存活率80.7％，ARM发生率98.7％，伴短尾畸形5.1％、无尾畸形94.8％、双足内翻6.4％、脊柱裂6.4％，畸形有单一发生，也有并发多种畸形；
　　 ② HE染色显示：ARM胎鼠肛门为一闭合盲端，无正常肛门结构，直肠盲端为增生鳞状上皮组织及增厚的肌层，未见肠腺分布；直肠末端粘膜下及肌间神经丛数量：ARM组：46.40±16.08，对照组：96.33±18.57，两组比较，P<0.05；
　　 ③免疫组织化学显示：NGF、TrkA、p75NTR主要分布在胎鼠直肠末端粘膜下及肌间神经丛，其中NGF主要分布在细胞核，TrkA分布在细胞质，p75NTR在细胞核、细胞质均有分布，NGF、TrkA、p75NTR在正常胎鼠直肠末端肠粘膜、肌层组织细胞核及细胞质中有大量表达，其积分光密度(IOD值)分别为731.75±232.18、262.82±101.72、134.67±67.13，而在ARM胎鼠直肠末端表达较少，其积分光密度(IOD值)分别为217.97±74.95、113.01±36.47、33.15±11.13，两组比较，P<0.05；
　　 ④ RT-PCR显示：TrkA、p75NTR在对照组直肠末端的相对表达量分别是162.22±104.68，129.78±51.98，在ARM组直肠末端的相对表达量分别是78.94±33.43，87.15±25.81，两组比较，P<0.05；扩增产物琼脂糖凝胶电泳显示：TrkA、p75NTR cDNA片段与引物设计的扩增片段长度完全吻合，TrkA、p75NTR条带亮度对照组均明显高于ARM组。
　　 结论：NGF及其受体TrkA、p75NTR在ARM胎鼠直肠末端表达异常，提示NGF、TrkA、p75NTR可能参与并影响了ARM直肠末端ENS的发育，这可能是导致肛门直肠畸形术后患儿排便功能障碍的原因之一。