ERK1/2磷酸化在哮喘小鼠气道黏液高分泌中的作用

摘要

第一部分哮喘小鼠模型的制备
　　 目的：建立哮喘小鼠模型并观察小鼠气道炎症及气道黏液分泌的情况。
　　 方法：清洁级BALB/c雄性小鼠20只随机分为两组：生理盐水对照(NS组)和哮喘组(AS组)，各10只。AS组于第1、13天腹腔注射卵清白蛋白(OVA)致敏，第19天开始雾化吸入5％OVA溶液30min，连续激发5天，制备哮喘小鼠模型，NS组以生理盐水代替OVA，处理方法同AS组。测定各组小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞总数和白细胞分类计数，以酶联免疫吸附试验(ELISA)检测BALF中IL-5和IL-32水平，阿尔辛蓝-过碘酸雪夫(AB-PAS)染色观察气道杯状细胞及气道分泌黏液，HE染色和VG染色观察肺组织病理学改变，RT-PCR、免疫组织化学(IHC)及免疫印迹法(Western blot)检测肺组织中黏蛋白Muc5ac mRNA及蛋白水平的表达。
　　 结果：AS组小鼠BALF中的细胞总数、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞及中性粒细胞计数、IL-5和IL-32水平、肺组织AB-PAS阳染面积、Muc5ac mRNA和蛋白表达均高于NS组，差异均有统计学意义(均P<0.01)。Western blot检测肺组织Muc5ac蛋白的表达与BALF细胞总数、嗜酸性粒细胞数、淋巴细胞、IL-32及气道AB-PAS染色的关系均呈正相关，其相关系数r值分别为0.990，0.979，0.986，0.987，0.992(均P<0.01)，与中性粒细胞及IL-5的关系也呈正相关，相关系数r值分别为0.947和0.960(P值分别为0.015和0.01)。
　　 结论：用OVA致敏和激发可成功建立较为理想的哮喘小鼠模型，哮喘小鼠出现以嗜酸性粒细胞浸润为主的气道慢性炎症和气道黏液高分泌的表现，且二者密切相关。
　　 第二部分 ERK1/2的磷酸化在哮喘小鼠气道黏液高分泌中的作用及药物干预的影响
　　 目的：观察地塞米松(dexamethasone)及U0126干预对哮喘小鼠肺组织细胞外信号调节蛋白激酶(ERK1/2)的磷酸化水平、IL-32及Muc5ac蛋白表达的影响，探讨ERK1/2的磷酸化在支气管哮喘小鼠气道黏液高分泌中的作用。
　　 方法：清洁级BALB/c雄性小鼠50只，随机分成生理盐水对照组(NS组)、哮喘组(AS组)、地塞米松干预组(AS+DEX组)、U0126干预组(AS+U0126组)及二甲基亚砜(DMSO)溶剂对照组(AS+DMSO组)，各10只。各干预组于雾化激发前30min腹腔注射药物干预，余处理同AS组。测定BALF中细胞总数和白细胞分类计数，ELISA法检测BALF中IL-5和IL-32水平，AB-PAS染色观察气道杯状细胞增生及气道黏液分泌的改变，HE染色和VG染色观察肺组织病理学改变，RT-PCR检测Muc5ac mRNA在肺组织内的表达，IHC和Western blot法检测肺组织Muc5ac、ERK1/2、p-ERK1/2及IL-32蛋白的表达。
　　 结果：AS组BALF中细胞总数、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、中性粒细胞计数、IL-5、IL-32水平、AB-PAS阳性表达面积、Muc5ac mRNA、Muc5ac、ERK、p-ERK及IL-32蛋白表达较NS组均增高，其差异均有统计学意义(均P<0.01)，与AS+DMSO组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；地塞米松和U0126可以抑制ERK1/2的磷酸化，且二者差异无统计学意义；各组小鼠Muc5ac mRNA和蛋白表达与ERK1/2的磷酸化水平呈高度正相关(r值分别为0.983、0.996，均P<0.01)，Muc5ac蛋白含量与ERK1/2的磷酸化水平成正相关(r值为0.903，P<0.05)，ERK1/2的磷酸化水平与IL-32的表达成显著正相关(r值为0.981，P<0.01)。
　　 结论：ERK1/2的磷酸化可能参与调控哮喘小鼠气道黏蛋白Muc5ac的基因表达及高分泌的改变，地塞米松和U0126可以抑制ERK1/2的磷酸化，其机制之一可能是通过下调IL-32的表达。