Fonsecaea monophora的致病性研究

摘要

目的:对疑是着色芽生菌病患者皮损分离的病原菌进行培养及菌种鉴定，并构建该菌种感染小鼠的动物模型，探索该菌种的致病性以及体外对有关抗真菌药物的敏感性。
　　 方法:取患者皮损及分泌物进行组织病理学及真菌学检查，对培养出来的病原菌菌种利用形态学技术进行初步鉴定；然后，再采用分子生物学技术对所获菌种进行基因鉴定。提取病原菌DNA，利用真菌通用引物ITS1和ITS4进行rDNA ITS区系列的PCR扩增，利用引物NS1和DNS6进行rDNA18S区序列的PCR扩增，扩增产物测序后在Genbank核酸数据库中进行同源性比对。按照CLSI制定的M38-A方案对菌株进行体外抗真菌药物敏感实验。动物模型采用ICR小鼠，分为：A组为实验组、B组为生理盐水对照组。接种部位：灌胃、皮肤、足垫、睾丸、脑室、腹腔；接种后每天观察接种部位及小鼠的变化；接种后15d、1、2个月逐次处死各组不同接种部位老鼠2只，取肉眼可见的病变组织行病理学、真菌学及分子生物学检查。
　　 结果:皮损组织病理为慢性肉芽肿样改变，可见圆形厚壁的硬壳细胞。皮损处分泌物及组织液在含氯霉素的SDA，PDA培养基上培养的菌落生长缓慢，呈橄榄色至灰黑色。小培养可见大量棕色分支分隔菌丝、分生孢子梗主要为喙枝孢型和枝孢型为主，枝状链及串状芽生孢子，呈椭圆形或卵圆形，单细胞。扩增真菌rDNA的ITS区得到554 bp的系列片段，rDNA的18S区得到1300 bp的系列片段，将PCR产物测序后获得的DNA系列片段在GeneBank核酸数据库中blansen比对结果：该病原菌的rDNA的18S区得到系列的片段分析将该菌种确定为着色真菌属，其rDNA的ITS区得到系列的片段，经序列分析与裴氏着色真菌m onophora(Fonsecaea monophora)的变种ITS区比对一致性为100％。结合患者组织病理、真菌学形态结构特征以及DNA序列分析，该菌种被鉴定为Fonsecaea monophora。体外药敏试验结果显示：该菌对伊曲康唑、特比萘芬、氟康唑、酮康唑均敏感。本例患者予以伊曲康唑联合外用抗真菌制剂治疗半年痊愈，但停药1个月复发。动物模型：灌胃接种未出现任何异常变化；皮内接种后随时间进展，出现结节、水疱、脓疱、溃疡、坏死、暗红色痂，萎缩伴黑色痂，皮下接种表皮未出现破溃和结痂；足垫接种见足垫肿胀增厚、跛行，余表现同皮内接种；腹腔接种早期体外未见明显变化，后期出现腹部膨隆，解剖见腹腔内大量腹水，受累脏器及其系膜粘连，表面布满粟粒至绿豆大黑色结节，同时受累的还有泌尿生殖系统、神经系统，有小鼠出现尿失禁及双后肢瘫痪，但胸腔未受累；睾丸接种出现阴囊肿胀发亮、脓疱、破溃，睾丸萎缩、发黑，解剖可见大量黑色结节沿睾丸组织种植播散到腹腔致腹腔内各脏器系统性感染；脑室接种见囟门区膨出黑色脓疱并逐渐增大，小鼠出现单侧眼球化脓性感染以致失明，15d后陆续死亡。整个实验过程中除脑室内接种小鼠全部死亡外，余未见死亡。实验组除灌胃接种未出现反应外，余接种途径均100％感染。对照组未出现任何反应。接种后的15d、1、2个月逐次处死各接种组2只老鼠，取肉眼可见的病变组织行病理学及真菌学检查，可见肉芽肿性炎症改变，病变组织中均可找到硬壳小体，培养见黑色菌落生长，镜下形态与皮损分泌物培养的菌的镜下形态相同。挑出黑色菌落再次进行分子生物学鉴定结果同前。结合组织病理学、真菌学及分子生物学将该菌种鉴定为Fonsecaea monophora，其引起的着色芽生菌病病程迁延，需长程治疗。
　　 结论:着色芽生菌新菌种Fonsecaea monophora通过分子生物学技术从裴氏着色霉中分离鉴定出来，其引起的着色芽生菌病需长程治疗。该菌种对伊曲康唑比其他抗真菌药物更敏感。成功构建小鼠多个系统感染Fonsecaea monophora动物模型，说明该菌有很强的致病性，危害性大。感染途径主要是通过直接接触播散，不易通过血液、淋巴、消化道传播。