芸芥体细胞胚胎发生及农杆菌介导遗传转化的研究

摘要

本研究通过实验建立了一个高频率的芸芥体细胞胚胎发生及植株再生体系，并在此基础上，研究了各种因素对芸芥体细胞胚胎发生、成熟和萌发的影响，优化了各种条件组合；探讨了芸芥体细胞胚胎发生的途径与起源；对芸芥体胚发生过程中基因在转录水平和翻译水平的差异表达进行了初步研究；建立了一个发根农杆菌R1000介导的芸芥高效遗传转化体系。主要研究结果如下：　　本研究以不同基因型芸芥为供试材料，研究了基因型、培养基成份、外植体种类及大小、PGRs的种类与浓度、外植体取材时间、低温预处理等因素对芸芥体细胞胚胎发生率的影响。通过细胞学方法对芸芥体细胞胚胎的起源及发生部位进行了研究。建立了芸芥胚性培养物的mRNA差别显示技术体系，利用此技术对芸芥体胚发生早期的mRNA差异表达进行了分析，初步获得了18条cDNA差异片段。采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，对芸芥体胚发生过程中可溶性蛋白质的动态变化进行了分析，并找到了一些与芸芥体胚发生相关的特异性蛋白。建立了芸芥体胚发生早期蛋白质的双向电泳技术体系。本研究对芸芥体细胞胚胎发生早期的蛋白质进行了双向电泳分析，经银染后，获得了清晰而稳定的图谱。通过对发根农杆菌遗传转化主要影响因素的研究，首次建立了农杆菌R1000介导的转化体系。

目录

文摘

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缩写词表

第一部分前言

一、植物体细胞胚胎的发生

二、植物体细胞胚胎发生的基因差别表达

三、植物体细胞胚胎发生体系在作物育种及其它研究领域的应用

四、发根农杆菌Ri质粒的研究与应用

五、十字花科植物体细胞胚胎发生及转基因研究进展

六、本研究的目的和意义

第二部分芸芥体细胞胚胎的发生研究

一、材料和方法

1.供试材料

2.实验方法

二、结果与分析

三、讨论

1.体细胞胚胎的发生

2.胚性愈伤组织的继代增殖

3.体细胞胚胎的成熟

4.体细胞胚胎的萌发

5.植株再生

四、小结

第三部分芸芥体细胞胚胎发生的细胞学观察

一、材料与方法

1.材料

2.操作步骤

3.体细胞胚胎发生的细胞学观察

4.体细胞胚胎的发育过程观察

二、结果与分析

1.芸芥体细胞胚胎发生的细胞学观察

2.芸芥体细胞胚胎的发育过程观察

三、讨论

1.植物体细胞胚胎发生的普遍性及意义

2.植物体细胞胚胎的发生途径

3.植物体细胞胚胎的起源方式

4.芸芥体细胞胚胎发生体系的优点

四、小结

附图

第四部分芸芥体胚发生早期基因的差别表达研究

一、实验材料与技术路线

1.植物材料

2.主要溶液及配制

3.技术路线

二、方法

1.总RNA的提取与鉴定

2.总RNA中微量DNA的去除

3.RT-PCR反应体系的建立

4.芸芥体细胞胚胎发生早期mRNA的差异显示分析

5.cDNA差异片段的克隆

三、结果与分析

四、讨论

五、小结

附图

第五部分芸芥体胚发生过程中蛋白质的差异表达研究

一、实验材料

1.植物材料

2.主要溶液及配制

二、芸芥体胚发生过程中可溶性蛋白质的SDS-PAGE电泳

1.样品的提取

2.样品浓度的测定

3.SDS-PAGE电泳

4.染色

5.图像分析

三、芸芥体胚发生早期蛋白质的双向电泳

1.样品的提取

1.蛋白质含量的测定

3.第一向等电聚焦(IEF)电泳

4.第二向SDS-PAGE电泳

四、结果与分析

五、讨论

五、小结

第六部分发根农杆菌对芸芥的遗传转化研究

一、材料与方法

1.材料

2.方法

二、结果与分析

三、讨论

四、小结

附图

参考文献

攻读博士学位期间发表的学术论

致谢