增强UV-B胁迫下蓝细菌NO信号的产生及其作用机理研究

摘要

近些年，大气污染，特别是氯氟烃(CFCs)的大量使用引起了臭氧层的破坏衰减，从而导致到达地球表面的紫外线-B(UV-B，280-320nm)辐射增强。增强UV-B辐射除了对陆生植物产生各种胁迫影响外，现已证明增强的UV-B能够穿入淡水及海洋中，对水生生物产生同样效应。增强UV-B对蓝细菌，特别是浅水水域及稻田中的蓝细菌产生很大影响。 增强UV-B可以诱导植物产生一氧化氮(NO)。作为新兴的信号分子，NO参与逆境胁迫下植物对胁迫的响应，相关研究在高等植物中比较多，但对增强UV-B胁迫下，蓝细菌细胞内NO信号的产生、传递和作用机制方面的研究目前还未见报道，因此本文以产氧蓝细菌-螺旋藻794(Spirulinaplatensis)为实验材料，通过不同强度UV-B胁迫及不同化学试剂处理，考察了螺旋藻细胞内NO的产生及其产生途径，研究了增强UV-B辐射下NO信号分子对螺旋藻细胞内抗氧化系统及其它代谢过程的影响，阐明了增强UV-B胁迫下蓝细菌细胞内NO的产生、产生途径及其作用机理，为进一步进行同类研究提供了科学依据。我们的实验得到如下结果： 1.通过不同强度UV-B胁迫及不同化学试剂处理，考察了螺旋藻794细胞内NO的产生及其产生途径，结果表明，增强UV-B胁迫下螺旋藻794细胞能够产生和释放NO信号分子，而且NO的产生量呈UV-B强度和胁迫时间相关性，随着UV-B强度的增大和胁迫时间的延长，NO的产生量逐渐增多。研究结果首次揭示了同高等真核生物一样，单细胞原核生物蓝细菌也对增强UV-B胁迫作出反应，产生NO信号分子，NO信号可能介导一系列生理生化过程，从而使蓝细菌对增强UV-B胁迫作出响应，这为进一步开展同类研究提供了科学依据和理论指导。 2.通过对细胞内NOS活性、NR活性、NiR活性、PAL活性及细胞中NO2-和NO3-含量进行测定分析，发现在增强UV-B胁迫下，螺旋藻794细胞细胞内NO的合成可通过NOS途径、NR途径、NiR途径、PAL途径产生，NR途径可能是主要途径，细胞内NO的合成不是通过单一途径完成的，而是通过多条途径，相互关联、相互制约共同完成NO的适量合成和释放，进而对UV-B胁迫作出应答。每一种酶对细胞总NO的贡献将依赖于细胞生长的时期及细胞内底物和因子的可利用性，而且可通过效应子的调节作用而发生改变，从而使NO严格地调节细胞的生理活性。本研究探明了增强UV-B胁迫下蓝细菌NO的产生途径，说明了蓝细菌中NO信号产生过程的相关性和复杂性，不但具有重要的理论价值，而且为进一步进行对NO信号分子的信号传导及代谢过程调控机制的研究奠定了科学基础，同时，为细胞内信号传导网络机理的构建提供了科学依据。 3.通过叶绿素a含量、蛋白质、MDA和生物量4个方面的变化证明了0.5mM的NO供体硝普钠(sodiumnitroprusside，SNP)对增强UV-B胁迫下的蓝细菌-螺旋藻794细胞氧化损伤有明显的减缓作用。 4.实验结果显示，NO能够显著诱导增强UV-B胁迫下螺旋藻细胞内SOD、POD和CAT活力的提高，延缓O2-的积累，促进抗氧化物质GSH的含量上升，从而减轻UV-B胁迫对螺旋藻细胞的氧化损伤。研究结果充分证实了增强UV-B胁迫及外源NO作用下蓝细菌能够通过增强细胞内抗氧化酶的活性及增加抗氧化物质的含量及时清除细胞内物质氧化过程所产生和积累的自由基，从而使细胞内的活性分子，特别是关键分子免受攻击，使细胞免遭伤害，也进一步证实了NO分子能够作为UV-B信号的下游信号(第二信使)起信号传导作用，调节细胞内酶代谢水平及物质转化过程，对细胞具有保护效应。研究结果说明，若能通过调节细胞的代谢过程提高细胞内源NO的水平，将提高细胞对逆境胁迫的适应能力。 5.增强UV-B(0.6J.m-2s-1)胁迫2h和4h，导致固氮蓝细菌-螺旋藻794细胞中固氮酶活性分别降低了86.03％和86.62％，而且呈明显的UV-B强度负相关。用增强UV-B和0.5mMSNP处理培养的螺旋藻794细胞6h后，与对照细胞相比，细胞中固氮酶的活性提高了47.3％。SNP明显地拮抗UV-B胁迫引起的固氮酶活性的降低。同样，NAC(一种自由基清除剂)处理显著地增强了UV-B胁迫的螺旋藻794细胞中固氮酶活性，而PTIO处理(一种NO清除剂)降低了固氮酶活性，这表明NO和自由基清除剂NAC能够拮抗增强UV-B辐射引起的固氮酶活性的丢失。研究结果表明增强UV-B胁迫对蓝细菌细胞内关键酶-固氮酶活性有降低作用，同时首次证明了NO信号分子对UV-B胁迫下蓝细菌固氮酶活性的降低具有拮抗作用，进一步表明NO信号分子能够通过信号传导过程对细胞内关键分子起保护作用，这将为逆境胁迫下蓝细菌固氮生物学机制的研究提供科学指导。 6.当把UV-B胁迫引起固氮酶活性抑制的螺旋藻794细胞转移到可见光下时，固氮酶活性不能得到恢复，说明酶活性的抑制可能是由于酶的特异性失活。当用蛋白质合成及光系统Ⅱ(PS-Ⅱ)的抑制剂处理时，结果显示还原剂和ATP限制了螺旋藻794细胞中固氮酶活性。研究结果说明固氮酶维持其活性需要足量还原剂和ATP的供给，也进一步证实了在把N2转化成NH3的过程中，固氮酶需要持续的、足量的适合还原剂和ATP供应的机制。上述结果说明增强UV-B胁迫引起固氮酶活性的降低主要是由于酶的特异性失活，而固氮酶的失活与细胞内还原剂及ATP的缺乏有关，这暗示增强UV-B胁迫引起固氮酶活性的降低可能与增强UV-B辐射影响细胞的光合作用有关，也暗示NO对固氮酶活性的保护效应可能与保护细胞光合膜免遭UV-B伤害有关。 7.进一步的研究结果表明，增强UV-B处理增加了硝酸还原酶活性，SNP和NAC能够进一步显著地提高增强UV-B辐射引起的硝酸还原酶活性的增强。研究结果表明增强UV-B胁迫及外源NO确实对细胞内关键酶分子活性产生影响，揭示了增强UV-B胁迫下蓝细菌中硝酸还原酶在细胞对逆境胁迫响应中的重要作用。进一步暗示硝酸还原酶活性途径可能是螺旋藻细胞NO产生的主要途径，也进一步证明了NO信号产生过程中的反馈调节机制。 8.通过不同强度UV-B胁迫及不同化学试剂处理不同时间，考察了螺旋藻细胞内多胺的产生和积累，结果表明，增强UV-B胁迫下螺旋藻细胞能够产生和积累多胺，而且多胺的积累量呈UV-B强度和胁迫时间相关性。多胺的产生对UV-B非常敏感，四种多胺中，Cad和Put对UV-B最敏感，而尸胺和亚精胺的产生量最多，最高含量分别达到对照细胞的7.29倍和2.07倍。增强UV-B胁迫下，螺旋藻794细胞内Spd+Spm及Spd+Spm+Cad含量增加，其与Put的比率，即(Spd+Spm)/Put和(Spd+Spm+Cad)/Put分别增加了6.06和29.48。首次研究发现在增强UV-B胁迫下蓝细菌细胞可产生和积累多胺，研究证实了增强UV-B胁迫下蓝细菌能够通过增加细胞中抗氧化物质/信号物质-多胺的产生和积累进一步增强细胞的信号传导能力及抗氧化活力，从而使细胞免遭UV-B的伤害，而且揭示了NO信号能够引起多胺信号物质的产生，暗示NO为多胺信号合成的重要信号分子并且位于多胺信号传导链的上游。进一步表明(Spd+Spm)/Put和(Spd+Spm+Cad)/Put比率的增加与细胞的抗氧化能力的增强有关。 9.通过不同强度UV-B胁迫及不同化学试剂处理不同时间，考察了螺旋藻细胞内似真菌孢子素氨基酸(MAA)的产生和积累，结果表明，增强UV-B胁迫下螺旋藻794细胞能够产生和积累MAA，而且MAA的积累量呈UV-B强度和胁迫时间相关性。结果还表明，增强UV-B胁迫下，细胞内产生了两种MAA，即shinorine和sporphyra-334，而且sporphyra-334的产生量明显多于shinorine。研究结果表明在增强UV-B辐射下，螺旋藻能够通过在细胞中合成和积累细胞屏蔽/保护物质MAA来滤除过多的UV-B，从而对细胞起保护作用，这充分说明逆境胁迫下蓝细菌具有自我保护机制及对逆境胁迫高度的适应能力。 10.研究还表明，NO信号分子及自由基清除剂NAC能够调节多胺的合成及MAA的积累，NO信号与多胺信号之间存在相关性，共同调节细胞内MAA的产生和积累。研究结果进一步揭示NO作为第二信使在细胞的信号传导中起关键作用，也说明了细胞内信号分子的相互作用及其在细胞代谢调节中的网络调节机制。 综上所述，本论文首次研究发现在增强UV-B胁迫下，单细胞原核生物蓝细菌能够产生和释放NO信号分子，探明了NO信号的产生途径，充分证实了增强UV-B胁迫下，NO信号分子对细胞抗氧化系统及氮素代谢等生理活动的影响，研究结果将为进一步开展同类研究提供科学依据和理论指导。

目录

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致谢

缩写词表（List of Abbreviations）

摘要

第一章前言

第二章增强UV-B胁迫下蓝细菌一氧化氮的产生及其产生途径的研究

第三章一氧化氮对增强UV-B胁迫下蓝细菌氧化损伤的减缓作用

第四章一氧化氮对增强UV-B胁迫诱导的蓝细菌氮固定酶活性变化的拮抗作用

第五章增强UV-B辐射及NO对多胺和MAA产生的影响

结 论

参考文献

在学期间发表和待发表的论文