黄连素对肝癌HepG细胞凋亡诱导及生长抑制作用的实验研究

摘要

目的；了解p53蛋白、cyclinD1和Caspase-3在人肝癌细胞株HepG2细胞上表达和定位；观察黄连素对人肝癌细胞株HepG2细胞的凋亡诱导及对其p53蛋白、cyclinD1和Caspase-3表达的影响，以进一步探讨黄连素诱导人肝癌细胞株HepG2细胞凋亡的可能机制。 方法；利用细胞培养技术制作细胞爬片，以免疫组织化学SABC法检测了p53蛋白、cyclinD1和Caspase-3在人肝癌细胞株HepG2细胞上表达和定位。将HepG2细胞培养体系分为黄连素组、阳性对照组和阴性对照组。黄连素组以不同浓度的黄连素处理；阳性对照组用不同浓度5-Fu处理；阴性对照组以细胞培养基+PBS处理。四甲基偶氮唑兰(MTT)比色法用以判断细胞的生长抑制率；免疫组织化学法用以测定p53、cyclinD1和Caspase-3的表达丰度；流式细胞术(FCM)及琼脂糖凝胶电泳法用以分析黄连素对HepG2的细胞周期及凋亡的影响。采用上述同样方法，研究黄连素对人正常肝细胞ChangLiver的生长抑制和凋亡诱导作用。 结果：(1)在人肝癌细胞株HepG2上，p53蛋白有较强的表达，主要分布于细胞核；CyclinD1表达丰度较强，主要分布于细胞核；Caspase-3的表达较少。(2)以空白对照组的生长抑制率为0，黄连素作用浓度为1.0μmol/L时，HepG2细胞在12、24、48、72h的生长抑制率(IR)分别为5.7％、8.8％、14.5％、19.6％；黄连素作用浓度为10μmol/L，HepG2细胞于12、24、48、72h的IR分别为9.6％、13.7％、19.2％、29.3％；黄连素作用浓度为10μmol/L时，HepG2细胞于12、24、48、72h的IR分别为14.3％、20.2％、29.6％、39.2％；与阴性对照组相比，各浓度组的各时间点的IR均有具有显著性升高，且呈时间-剂量依赖关系。与阳性对照组相比，上述浓度黄连素对HepG2细胞的生长抑制作用则无显著性差异。(3)免疫组织化学分析显示，经黄连素、5-Fu处理的HepG2细胞，其突变型p53、CyclinD1表达水平较阴性对照组显著降低，而Caspase-3的表达明显增强，黄连素与5-Fu作用的两组间则无显著性差异。(4)流式细胞技术检测表明，黄连素能使HepG2细胞G0/G1期比例明显增加，S期和G2期HepG2细胞比例明显下降，即细胞被阻滞在G0/G1期；实验组细胞凋亡率为36.9％，与阴性对照组细胞凋亡率(6.3％)相比明显下降(P＜0.01)。琼脂糖凝胶电泳显示，实验组和阳性对照组在作用72h时有明显的ladder凋亡带，而阴性对照组则未显示凋亡带。 结论：(1)在人肝癌细胞株HepG2上，p53蛋白和cyclinD1在细胞核上呈强阳性表达；而Caspase-3呈弱阳性表达。(2)一定浓度的黄连素对人肝癌HepG2细胞有显著的生长抑制作用；黄连素可诱导HepG2细胞凋亡；黄连素可使HepG2细胞阻抑于G0/G1期。(3)Caspase-3和CyclinD1在黄连素诱导肝癌HepG2细胞凋亡和细胞周期阻抑的过程中发挥着重要的调控作用。

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讨 论

结 论

参考文献

附 图

致 谢

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