扶正解毒汤对硫酸镍诱发16HBE细胞遗传毒性及致癌性的抑制作用研究

摘要

目的: 建立硫酸镍 (NiSO<,4>) 暴露人支气管上皮细胞系(16HBE)后诱发遗传损伤以及诱导16HBE细胞恶性转化的体外实验模型，研究中药扶正解毒汤(FJD)含药血清对NiSO<,4>遗传毒性及致癌性的拮抗作用，并初步探讨其作用机制。 方法: 一、常规16HBE细胞体外培养；青紫兰兔被随机分为 4 组，每组4只，3组予以FJD，1组给予生理盐水连续灌胃3d后，采血，分离血清，制备低、中、高剂量FJD兔含药血清及空白血清冻干粉；实验设NiSO<,4>暴露组(终浓度50-800 μ mol/L)、FJD血清与NiSO<,4>共处理组(终浓度均为10％体积分数的低、中、高剂量FJD血清+NiSO<,4>)、空白血清与NiSO<,4>共处理组(终浓度为10％体积分数的空白血清+NiSO<,4>)、阴性对照组(MEM或RPMI1640培养基)及亚硝基胍(MNNG)、丝裂霉素(MMC)或环磷酰胺(CP)阳性对照组；采用细胞克隆形成率试验、苔盼蓝法及四甲基固氮唑盐(MTT)比色法进行受试物细胞毒性实验。 二、采用氚．胸腺嘧啶核苷(<'3>H-TdR)掺入法、单细胞凝胶电泳(SCGE)技术、胞质阻断(CB)法体外微核(MN)试验、体外染色体畸变(CA)试验及体外姊妹染色单体交换(SCE)试验等细胞遗传学方法，研究FJD血清对NiSO<,4>诱发16HBE细胞非程序DNA合成(UDS)、DNA损伤(DNA单链断裂，SSB)、MN形成、CA及SCE的拮抗作用；观察NiSO<,4>诱导16HBE细胞转化的毒性作用，利用刀豆凝集素A(Con A)凝集实验和软琼脂集落形成实验进行转化细胞的恶性表型鉴定，同时观察添加不同剂量FJD含药血清后其对NiSO<,4>的抗转化效应；通过细胞形态学观察及MTT试验，研究FJD血清对NiSO<,4>转化细胞(Nt16HBE)增殖的抑制作用，同时分别以流式细胞仪(FCM)、TRAP-PCR-ELISA法及免疫细胞化学(immunocytochemistry)方法，观察FJD血清对Nt16HBE细胞核转录因子-кB(NF-кB)、端粒酶(telomerase)活性及P53蛋白表达变化的影响。 三、采用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)技术，分析FJD血清对染镍16HBE细胞内自由基含量，镍、钙、镁、锌四种离子浓度及线粒体含量变化(荧光像素数)的影响；设计以FJD含药血清预处理、NiSO<,4>后暴露或FJD含药血清与NiSO<,4>同时处理16HBE细胞两种实验方法，采用荧光实时定量PT-PCR技术，观察FJD血清对染镍16HBE细胞8－羟基－2’－脱氧鸟苷三磷酸酶 (8-oxo-dGTPase)表达变化的影响；分别检测细胞GSH-Px、SOD活性及氧自由基中间代谢产物MDA含量。 结果: 一、经苔盼蓝计数，当NiSO<,4>剂量分别为 50、100、200、400μmol/L时，细胞存活率均不低于90％，与FJD血清共同处理时，细胞存活率均大于90％，且各组间差异无显著性。NiSO<,4>剂量为800μmol/L时，细胞存活率低于90％，选择400μmol/L 作为NiSO<,4>实验剂量。 二、NiSO<,4>(400μmol/L)暴露的16HBE细胞UDS水平明显高于阴性对照组(P<0.01)，FJD血清对16HBE细胞UDS无诱导效应，但可以剂量依赖性方式抑制NiSO<,4>诱导的UDS。SCGE结果显示，随着NiSO<,4>浓度的增加、暴露时间的延长，“彗星”样细胞出现率(计数一定量细胞中彗星样细胞所占的比例)、尾长、Olive尾矩、尾DNA％、尾长/头长比均逐渐增高：与NiSO<,4>(400μmoFL)组相比，FJD血清与NiSO<,4>共处理组有少数彗星散步，但彗星尾长等指标的检测值均不同程度降低(P<0.05，P<0.01)，尤以作用16h后变化最为明显。与阴性对照组相比，NiSO<,4>(400μmol/L)暴露组细胞MN率增高，与NiSO<,4>暴露组相比，低、中、高剂量FJD血清与NiSO<,4>共处理组细胞MN率分别为(62.4±11.5)‰、(31.2±3.7)‰及(20.6±2.3)‰，显著低于NiSO<,4>暴露组(93.4±14.2)‰(P<0.05，P<0.01)。与阴性对照组相比，NiSO<,4>(400μmol/L)暴露组细胞CA率增高；FJD血清与NiSO<,4>共处理组细胞CA率分别为9％、4％、2％，显著低于NiSO<,4>暴露组31％(P<0.05，P<0.01)。与阴性对照组相比，NiSO<,4>(400μ mol/L) 暴露组细胞SCE频率增高：FJD血清与NiSO<,4>共处理组细胞SCE频率分别为(3.31±0.68)/cell、(1.58±0.27)/cell、(1.24±0.82)/cell，显著低于NiSO<,4>暴露组(6.83±0.21)/cell(P<0.05，P<0.01)。NiSO<,4>(400μmol/L)反复暴露16HBE细胞8次(20代)后，细胞生长速度明显加快，排列紊乱，失去接触抑制，出现复层生长，可被ConA凝集，并可在软琼脂上生长。三种剂量FJD血清与NiSO<,4>共处理组细胞转化率分别为0.82％、0.47％和0.19％，明显低于NiSO<,4>组(4.13％)，且呈剂量－效应关系，共处理组细胞ConA凝集反应阴性，不能在软琼脂上生长。三种剂量FJD血清可显著抑制Nt16HBE细胞生长，呈剂量－效应关系和时间－效应关系，且可明显抑制Nt16HBE细胞NF-к B、端粒酶活性及P53蛋白表达(P<0.05，P<0.01)。 三、与阴性对照组相比，NiSO<,4>(400μmol/L)暴露组细胞内GSH-Px、SOD活性下降，MDA含量增高，8-oxo-dGTPase表达上调(P<0.05，P<0.01，RSD>2％)；FJD血清与NiSO<,4>共处理组细胞内GSH-Px、SOD活性逐渐上升，MDA含量则降低，8-oxo-dGTPase呈低表达，与NiSO<,4>组相比，差异有显著性 (P<0.05，P<0.01，RSD>2％)。LSCM检测的荧光像素数结果显示，与阴性对照组相比，NiSO<,4> (400μmol/L)暴露组细胞[Ni<'2+>]、[ca<'2+>]及自由基含量增高，[Mg<'2+>]、[Zn<'2+>]及线粒体含量降低 (P<0.05，P<0.01)，FJD血清与NiSO<,4>共处理细胞后，上述各项检测指标均发生了相反的变化，与NiSO<,4>组相比，差异有显著性 (P<0.05，P<0.01)。 结论: 一、建立了NiSO<,4>暴露16HBE细胞诱发遗传损伤及恶性转化的体外实验模型，为进行中药干预镍化合物遗传毒性及致癌性研究奠定了基础。 二、低、中、高剂量FJD兔含药血清本身无细胞毒性、致突变性及诱导细胞转化作用，空白血清对实验结果不产生影响。 三、FJD含药血清对NiSO<,4>诱发16HBE细胞UDS、SSB、MN形成、CA及SCE均有一定的抑制作用，且此作用存在剂量－效应关系或时间－效应关系。FJD显示出体外抗镍遗传毒性即抗突变效应。 四、FJD含药血清对NiSO<,4>暴露后诱导16HBE细胞恶性转化具有阻抑作用，可以剂量依赖或时间依赖性方式显著抑制镍转化细胞(Nt16HBE)的增殖，促进其恶性表型的逆转，其机制可能与FJD下调Ntl6HBE细胞NF-кB、端粒酶活性及P53蛋白表达有关。表明，FJD含药血清具有一定的体外抗镍致癌作用。 五、FJD血清对镍暴露诱发的氧化应激具有明确的拮抗作用且存在剂量－效应关系。FJD血清可能通过细胞外及细胞内两种途径发挥抗氧化、清除自由基效应，从而有助于进一步阐明其体外拮抗镍遗传毒性、致癌性的作用机制。 六、NiSO<,4>体外暴露16HBE细胞可引发细胞内 Ni<'2+>、Ca<'2+>浓度的升高、 Mg<'2+>、Zn<'2+>及线粒体含量的下降，向NiSO<,4>暴露的培养体系中加入FJD含药血清，通过其多重作用机制可使上述失衡状态得以逆转，从而减少镍暴露诱发细胞遗传毒性及恶性转化的几率。

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论文说明:缩略语表

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前言

1实验材料准备

1.1细胞与动物

1.2中药制备

1.3暴露化学物

1.4细胞培养

1.5含药血清冻干粉的制备

1.6含药血清培养基的配制

2 FJD含药血清对硫酸镍诱发16HBE细胞遗传毒性的拮抗作用研究

2.1 FJD含药血清对硫酸镍诱发16HBE细胞非程序DNA合成的影响

2.2 FJD含药血清对硫酸镍诱发16HBE细胞DNA单链断裂的抑制作用

2.3 FJD含药血清对硫酸镍诱发16HBE细胞微核形成的抑制作用

2.4 FJD含药血清对染镍16HBE细胞染色体畸变、姊妹染色单体交换的抑制作用

3 FJD含药血清拮抗镍致癌性的体外实验研究

3.1 FJD含药血清对硫酸镍诱导16HBE细胞恶性转化的抑制作用

3.2 FJD含药血清对镍转化细胞(Nt16HBE)细胞增殖的抑制作用

4 FJD对染镍16HBE细胞氧化应激的抑制作用研究

4.1激光扫描共聚焦显微镜检测FJD含药血清对染镍16HBE细胞内自由基含量的影响

4.2 FJD含药血清对染镍16HBE细胞内GSH-Px、SOD活性及MDA含量变化的影响

4.3 FJD含药血清对染镍16HBE细胞内8-羟基-2'-脱氧鸟苷三磷酸酶表达的影响

5FJD含药血清对染镍16HBE细胞内镍、钙、镁、锌离子及线粒体浓度变化的影响

5.1试剂与仪器

5.2方法

5.3结果

5.4讨论

结语

参考文献

攻读学位期间的研究成果

致谢