大鼠脊髓损伤修复相关新基因Scirr27的生物学特性及Scirr10功能的初步研究

摘要

前期通过建立大鼠脊髓原代神经元分离培养以及脊髓原代神经元细胞体外损伤，成功建立了一个可靠的神经元体外损伤模型。利用基于PCR的改良锚定消减杂交技术获取了大鼠脊髓原代神经元损伤后差异表达基因，从这些差异表达基因中筛选出30条和大鼠脊髓损伤与修复相关的表达序列标签(expressedsequence tags，EST)。在对其进行生物信息学分析后，选取功能线索明确的新基因Scirr27和ScirrlO为深入研究的基因，本文主要围绕Scirr27基因的基本生物学特性及及SCIRPlO蛋白在脊髓损伤修复中的可能功能进行了研究。 生物信息学分析EST27，包括载体片段去除、基因组定位、基因开放可读框(Open Reading Frame，ORF)预测、基因编码蛋白结构域预测。Scirr27可编码NGF诱导蛋白domain，属于tob/btgl家族，此家族蛋白通常在胚胎发育的早期，神经元发育成熟前表达，具有抑制细胞增殖的作用。我们根据EST27已知的基因序列，通过NCBI中的核酸序列比对平台BLAST，找到了Scirr27高度同源基因PC3B，预测了Scirr27开放可读框，设计了ORF两端引物，通过NGF诱导PC12细胞分化为神经元样细胞，PCR扩增获得了Scirr27的基因序列。原位杂交技术研究了该基因在Wistar大鼠脊髓损伤后表达的变化，实验表明，Scirr27基因在成年大鼠脊髓损伤过程中表达明显上调，提示它参与了损伤组织的修复过程。 SCIRP10蛋白编码171个氨基酸，属于Cytochrome b5-like Heme/Steroid binding domain(Cyt-b5)家族蛋白，与小鼠来源的具有神经营养活性的新分泌蛋白Neudesin高度同源。这个家族的蛋白包含有血红蛋白、类固醇、几丁质合酶结合区和孕烯醇酮受体区，其N端的α螺旋穿越跨膜区。前期我们利用酵母双杂交技术和Pull Down技术筛选出同SCIRP10相互作用的蛋白一促甲状腺素释放激素受体2 (TRHR2)。本实验从体内进一步验证了SCIRP10蛋白与TRHR2蛋白的相互作用，并摸索一种新的模型研究SCIRP10的神经营养活性。以上的研究结果为深入探讨Scirr27基因和SCIRR10蛋白在脊髓损伤修复中的作用机理奠定了良好的基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

引言

第一部分大鼠脊髓损伤修复相关新基因Scirr27的生物信息学分析与ORF克隆

第一节Scirr27的生物信息学分析

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、小节

第二节Scirr27 ORF的克隆

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、小结

第三节原位杂交显示Scirr27基因在损伤与正常大鼠脊髓中表达的情况

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、小结

讨论

第二部分大鼠脊髓损伤修复相关新基因Scirr10的功能的初步研究

第一节SCIRP10蛋白与TRHR2相互作用的进一步验证

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、小结

第二节“双凹一梁”模型的初步摸索

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、小结

讨论

参考文献

附录

致谢