Livin反义寡核苷酸对人乳腺癌细胞株MCF-7增殖和凋亡的影响

摘要

本实验选取人乳腺癌细胞MCF-7为研究对象，针对人类Livin mRNA设计合成能特异性地阻抑Livin表达的反义寡核苷酸(antisense oligidexynucleotide，ASODN)，观察ASODN抑制MCF-7细胞的体外增殖和Livin mRNA的表达，促进肿瘤细胞凋亡的作用。为针对Livin基因的反义治疗策略及临床抗肿瘤药物开发提供新的手段。 方法 设计合成特异性的Livin硫代磷酸ASODN及其对照错义寡核苷酸(missense oligodeoxynucleotides，MSODN)，其中反义链(Antisense strand)是与LiVin mRNA翻译起始区域20个碱基序列(包括起始密码ATG)互补的反义寡核苷酸片段，错义链(Missense strand)与Livin mRNA无配对关系，且不与任何人类已知基因互补。根据作用药物不同，分为ASODN作用组(处理药物为ASODN)、MSODN作用组(处理药物为MSODN)和RPMI-1640作用组(处理药物为单纯无血清RPMI-1640)。上述药物作用于人乳腺癌细胞株MCF-7，采用MTT法检测Livin ASODN对MCF-7细胞的增殖抑制作用，RT-PCR检测Livin mRNA的表达水平，电镜、倒置显微镜、HE染色、流式细胞仪(FCM)以及吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)细胞染色法检测细胞凋亡水平和形态学改变。 结果 1．与对照组相比ASODN对MCF-7细胞的增殖抑制呈浓度依赖性，其浓度在2.5 μmol/L～10 μmol/L时具有显著性，当ASODN为10 μmol/L，作用MCF-7 48h时，抑制率最大为44.11﹪，IC<,50>= 3.44μmol/L。而当ASODN达到20 μmol/L或作用72 h时，其抑制细胞增殖的作用不再增加，并有所减弱。MSODN在高浓度20 μmol/L时，对,MCF-7细胞具有细胞毒作用，在2.5 μmol/L～10 μmol/L浓度区间仅有浓度依赖性轻度细胞毒作用的趋势，无统计学上的差异。 2．MCF-7细胞经ASODN作用后，电镜结果显示：细胞出现典型的凋亡形态学改变：核染色质固缩凝结，形成高密度电子斑块；内质网扩张呈空泡状；染色质边集；核裂解为高密度斑块，周围有质膜包围，形成凋亡小体。RPMI-1640组和MSODN组细胞胞膜完整，细胞表面较多细小突起，核浆比例大，细胞器丰富。 3．倒置显微镜观察：细胞经10μmol/L Livin ASODN作用48小时后，在倒置显微镜下观察并拍照发现细胞形态学变化明显：细胞由不规则星状向圆形改变，细胞边缘不整、出现皱缩、变圆、脱落和漂浮细胞增多;细胞间接触变松，界限变模糊，细胞间隙增大，增殖减慢。而RPMI-1640组和MSODN组细胞生长旺盛，轮廓清晰，呈梭形，贴壁生长良好，没有明显的细胞形态学变化。 4．HE染色结果：RPMI-1640组和MSODN组细胞分布较密集，细胞呈星状，扁平，体积较大，细胞均质，胞浆深染，核膜、核仁轮廓明显，染色深，多见核分裂相，细胞壁光滑，折光性好；而ASODN组可见细胞数目明显减少，细胞体积变小，细胞见疏松，胞浆浓缩。 5．RT-PCR结果证实：10 μmol/L的Livin ASODN作用MCF-7细胞48h后可明显降低Livin mRNA的表达，而MSODN组在相同浓度下无此作用。 6．流式细胞仪分析：与RPMI-1640组相比，ASODN组凋亡细胞增加了26.82﹪，而MSODN组没有明显的凋亡细胞增加。 7．AO/EB荧光染色显示：ASODN组凋亡细胞多见呈橘红色荧光，外形呈固缩或圆珠状。RPMI-1640组和MSODN组细胞核染色质结构正常．细胞核呈均匀绿色荧光。 结论 1．Livin ASODN能有效抑制乳腺癌细胞株MCF-7的体外增殖。 2．Livin ASODN能降低乳腺癌细胞株MCF-7中Livin mRNA的表达，抑制Livin自身抗凋亡作用从而促使肿瘤细胞凋亡。

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