二-（6-羟基-4-氧代-4H-苯并吡喃-3-基）-乙二亚胺在HeLa细胞中上调p53的凋亡作用

摘要

背景：人乳头瘤状病毒 (Human Papillomavirus，HPV)感染是宫颈癌的主要病因。HPV编码的E6蛋白与p53蛋白和细胞内的E6相关蛋白(E6 associated protein，E6-AP)结合，经过泛素途径使p53降解，使正常细胞发生癌变，形成恶性肿瘤。p53的细胞内活性作用是维持遗传的稳定性，这主要体现在对细胞周期的阻滞、促进细胞凋亡和DNA修复。MDM2蛋白是细胞内调节p53浓度及活性的重要蛋白质，两者构成似电流环路中的负反馈，彼此相互进行精细的调节。MDM2以介导p53穿过核膜进入胞浆降解和对p53转录活性的直接抑制作用两种形式实现对p53功能的调节。黄酮类化合物(flavonoids compounds)是植物次生代谢产物，广泛地存在于自然植物中，结构类型复杂多样，表现出多种多样的药理活性，能防治心脑血管系统的疾病和呼吸系统的疾病，具有抗炎抑菌，降血糖，抗氧化，抗辐射，抗癌，抗肿瘤以及增强免疫能力等药理作用。黄酮类化合物已成为目前新药开发的热点。 方法：用新合成的黄酮希夫碱二-(6-羟基-4-氧代-4H-苯并吡喃-3-基)-乙二亚胺 (bis(6-hydroxy-4-OXO-4H-chromene-3-yl)-ethylenediimine， B6)在不同浓度下对Hela细胞处理不同时间。采用SRB、台盼蓝染色、检测化合物对Hela细胞的抑制作用；在相差显微镜下观察化合物的作用所引起的细胞形态的改变；用AO/EB双染，观察细胞的凋亡形态：琼脂糖凝胶电泳，化合物作用的细胞DNA形成条带；透射电镜观察细胞形成的凋亡小体；流式细胞术检测Hela细胞的凋亡以及细胞周期的阻滞；Westem Blot检测p53、MDM2蛋白表达的变化。 结果： SRB法检测到24h对Hela细胞的IC<,50>为43.51μmol/L，；台盼蓝染色检测到化合物24h对Hela细胞有明显的抑制作用；相差显微镜和AO/EB双染紫外激发荧光显微镜下均观察到细胞质膜分离，细胞产生调亡小体；琼脂糖凝胶电泳紫外激发下可以观察到DNA在180～200bp间形成梯状条带；透射电镜下看到细胞染色质固缩、分离并沿核膜分布，细胞质亦发生固缩，细胞凋亡前体；流式细胞仪检测细胞被阻滞在G1期，细胞发生凋亡，调亡率在0μmol/L、40μmol/L、80μmol/L浓度时分别为0.05﹪，6.1﹪，8.6﹪；Western Blot检测p53蛋白的量随化合物浓度增加而增加，MDM2蛋白的量随p53蛋白的量增加而增加。以上结果说明该化合物能够诱导Hela细胞发生凋亡，促进p53表达，促使细胞凋亡，是一种具有抗肿瘤活性的化合物。

目录

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英文文摘

声明

第一章 前言

1.1宫颈癌研究现状

1.1.1宫颈癌的发病人群及分布

1.1.2宫颈癌的病因学研究史

1.1.3人乳头状瘤病毒(HPV)

1.1.4人乳头状瘤病毒致癌机制

1.2 p53在Hela中的表达及抗肿瘤机制

1.2.1 p53通路

1.2.2 p53蛋白的结构

1.2.3激活p53基因网络功能的上游分子事件

1.2.4细胞内p53蛋白表达水平的维持和调节

1.2.5 p53基因功能

1.3黄酮及黄酮类化合物的研究现状

1.3.1.黄酮类化合物的功能结构

1.3.2.药理作用及构效关系

第二章 材料与方法

2.1.SRB法测定药物对癌细胞杀伤作用的选择

2.2.台盼蓝染色实验

2.3.相差显微镜下观察化合物作用后形态学结构改变

2.4.AO/EB双染检测细胞调亡

2.5.调亡细胞的DNA检测

2.6.流式细胞仪测细胞调亡

2.7.Western Blot

第三章结果与讨论

3.1、SRB法测定B6的细胞毒活性有杀伤作用

3.2台盼蓝拒染实验B6对Hela细胞有杀伤活性

3.3相差显微镜下化合物作用后Hela细胞出现凋亡

3.4 AO/EB双染后检测到细胞凋亡

3.5凝胶电泳检测到Hela细胞DNA断裂

3.6电镜下调亡小体的形态

3.7流式细胞仪测Hela细胞的凋亡峰

3.8 Western Blotting检测到p53上调表达

总结

参考文献

在学期间参与的研究成果

致谢