NADPH氧化酶在H2O2双向调节血管生成中的重要作用以及天然抗氧化物马先蒿甙G的抑制血管和肿瘤生成作用

摘要

血管生成是以内皮细胞活化、细胞外基质降解、内皮细胞迁移、增殖、最终形成血管样结构为主要特征、受多种因素调节的、复杂的生理和病理过程，在此过程中活性氧(reactive oxygen species，ROS)发挥着重要作用。活性氧是细胞有氧代谢的产物，大量的活性氧会引起包括癌症在内的多种疾病，而人们对适量活性氧的认识已经从过去错误地定性为“毒性分子”重新评价为“信号分子”了。活性氧在肿瘤发生及血管生成中的信号传导作用日益受到重视，肿瘤发生、血管生成过程中ROS的来源也已成为研究的热点，其中NADPH氧化酶被认为是血管内皮细胞产生ROS的重要酶。 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(磷酸)氧化酶(nicotinamide adeninedinucleotide(phosphate)oxidase，NADPH oxidase)是一种吞噬细胞的专有酶系，负责呼吸爆发时产生活性氧来杀死入侵的病原微生物。但从上世纪80年代中期开始，发现一些非吞噬细胞，如内皮细胞、平滑肌细胞、神经细胞等也有NADPH氧化酶同系物的表达。血管NADPH氧化酶(Vascular NADPH oxidases)是动脉粥样硬化及糖尿病性血管系统疾病中活性氧的主要来源。 为了阐明ROS在血管生成中的作用及其可能的机理，本文研究了外源性H<,2>O<,2>对内皮细胞的增殖、迁移和鸡胚尿囊绒毛膜血管生成的影响以及内皮细胞NADPH氧化酶在此过程中的作用，同时观察了苯丙素甙类(phenylpropanoid glycosides)天然抗氧化剂马先蒿甙G对血管生成、肿瘤形成及生长的影响和作用机理。结果表明： 1．活性氧成员之一H<,2>O<,2>，在低浓度时(10 μmol/L)可以显著促进内皮细胞的增殖和迁移；但当浓度增加时，增殖和迁移受到抑制。可见H<,2>O<,2>对内皮细胞的增殖和迁移这些血管生成指标呈现出低浓度促进、高浓度抑制的双向调节作用。低浓度的H<,2>O<,2>(低于100μmol/L)对内皮细胞凋亡没有显著影响，200 μmol/L H<,2>O<,2>最大程度地诱导内皮细胞凋亡，浓度继续增大至300、400、500 μmol/L时，表现出细胞毒作用，死亡细胞多于凋亡细胞，凋亡率非但没有继续增加，反而降低。 2．就鸡胚尿囊绒毛膜血管生成而言，低浓度H<,2>O<,2>(1、2 nmol/cm<<'2>)轻微促进血管生成，4 nmol/cm<'2> H<,2>O<,2>最大程度地促血管生成，而再高于此浓度则呈现抑制效果。可见，H<,2>O<,2>对于体内血管生成也具有双向调节作用。 3．NADPH氧化酶抑制剂DPI对于正常状态和H<,2>O<,2>诱导的内皮细胞增殖、迁移、凋亡以及鸡胚尿囊绒毛膜血管生成均具有抑制作用，说明NADPH氧化酶介导了H<,2>O<,2>对血管生成的调节作用，同时也表明NADPH氧化酶是内皮细胞正常增殖、迁移以及体内血管生成过程中所需ROS的主要酶源。 4．抗氧化剂马先蒿甙G降低了内皮细胞ROS的水平，抑制内皮细胞的增殖和迁移，以及在体血管生成。也降低了肝癌细胞内ROS的水平，抑制肝癌细胞的增殖和迁移，抑制接种于鸡胚尿囊绒毛膜的肝癌细胞形成肿瘤的生长。而预先经马先蒿甙G处理的肝癌细胞再接种于鸡胚尿囊绒毛膜上，使成瘤率减低，说明马先蒿甙G降低了癌细胞的毒性使癌细胞向正常逆转。总之，马先蒿甙G通过降低细胞内ROS水平，起到抗血管生成和抗肿瘤生成的双重作用。 根据以上结果可以认为，以NADPH氧化酶介导产生的细胞活性氧，双相性地调控着体外及体内血管生成。当用抗氧化剂降低活性氧水平时，表现出抑制体内外血管生成，同时癌细胞的增殖也受到抑制，癌细胞发生了朝向正常化的逆转，即无论癌的发生和癌的生长都被抑制了。可见，NADPH氧化酶和抗氧化剂是血管生成、肿瘤发生的上游关键点和调控点。许多疾病如肿瘤、慢性炎症、糖尿病等的发生发展都依赖于血管生成，因此抑制血管生成有助于这些疾病的治疗；而对许多缺血性疾病如冠状动脉缺血、急性下肢缺血和脑梗塞等来说，促进血管生成可作为治疗的关键点之一。通过激活或抑制NADPH氧化酶以及选择抗氧化剂的剂量来调节细胞内活性氧的水平从而调控血管生成和肿瘤生成，可作为通过抗氧化来防治包括肿瘤或冠状动脉缺血等各种相关疾病的首选方案,本研究为此提供了基础数据。

目录

声明

摘要

前言

1.NADPH氧化酶介导产生活性氧

1.1细胞内多条途径产生活性氧

1.2非吞噬细胞中NADPH氧化酶及其产生的活性氧

2.血管生成与活性氧

2.1血管生成与血管发生

2.2血管生成与肿瘤发生的关系

2.3活性氧对血管生成的调节

3.内皮细胞NADPH氧化酶介导产生的活性氧在血管生成中的作用

3.1 NADPH氧化酶是血管细胞内活性氧的主要来源

3.2 NADPH氧化酶与神经系统疾病

4.活性氧与癌的发生

4.1癌细胞内H2O2水平升高

4.2 H2O2选择性杀死癌细胞，癌细胞对于H2O2导致的细胞死亡比正常细胞更敏感

4.3抗氧化剂、H2O2与癌症治疗

5.天然抗氧化产物的抗血管生成作用

6.研究目的

材料和方法

1.试剂和材料

2.血管生成指标

2.1细胞培养

2.2细胞内超氧阴离子O2·-的测定

2.3细胞增殖试验——SRB法

2.4细胞迁移试验——刮除法

2.5细胞凋亡测定

2.6鸡胚尿囊绒毛膜血管生成实验

3.抗血管和抗肿瘤作用指标

3.1细胞株

3.2细胞内活性氧(ROS)测定

3.3鸡胚尿囊绒毛膜血管生成实验

3.4鸡胚尿囊绒毛膜肿瘤形成实验

3.5鸡胚尿囊绒毛膜肿瘤生长实验

4统计分析

结果

1.NADPH氧化酶在H2O2双向调节血管生成中的重要作用

1.1不同浓度H2O2诱导内皮细胞产生不同量的O2·-，NADPH氧化酶是此O2·-的重要来源。

1.2低浓度H2O2促进内皮细胞增殖，此过程需要NADPH氧化酶参与

1.3低浓度H2O2促进内皮细胞迁移，NADPH氧化酶介导此过程

1.4适当浓度H2O2促进鸡胚尿囊绒毛膜血管生成，NADPH氧化酶抑制剂-DPI抑制其生长

1.5高浓度H2O诱导内皮细胞凋亡，NADPH氧化酶参与此过程

2.天然抗氧化物马先蒿甙G的抗血管和抗肿瘤生成作用

2.1马先蒿甙G抑制内皮及肿瘤细胞的增殖

2.2马先蒿甙G抑制内皮及肿瘤细胞的迁移

2.3马先蒿甙G抑制鸡胚尿囊绒毛膜血管生成

2.4马先蒿甙G抑制鸡胚尿囊绒毛膜上肿瘤的形成

2.5马先蒿甙G抑制鸡胚尿囊绒毛膜上肿瘤的生长

2.6马先蒿甙G降低内皮及肿瘤细胞内ROS的水平

讨论

1.H2O2双向调节内皮细胞增殖、迁移、凋亡以及在体血管生成

2.抗氧化剂马先蒿甙G兼具抗血管生成和抗肿瘤生成作用

3.NADPH氧化酶是血管内皮细胞产生活性氧的主要酶系

4.小结

参考文献

在学期间发表文章

致谢