siRNA沉默Nrf2基因对骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠急性心肌梗死的影响及机制研究

摘要

目的:核因子E2相关因子2(Nuclear factor-erythroid2-related factor2, Nrf2)是一种抑制氧化应激的转录因子。本研究采用Nrf2-siRNA﹠EGFP融合基因重组慢病毒载体修饰大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs),观察体外模拟炎性环境中沉默Nrf2基因对MSCs的生物学特征的影响;同时在体内观察其对骨髓间充质干细胞参与修复大鼠急性心肌梗死(Acute myocardial infarction, AMI)的影响及其相关机制,以期为心肌梗死后氧化应激环境的改善及心功能的治疗探索新的途径。
　　方法:
　　体外实验:按本课题组成熟的实验方法进行MSCs的体外分离、培养及传代,并收集第三代(P3)细胞进行流式细胞仪技术鉴定;购买携带EGFP的Nrf2 siRNA慢病毒和空载慢病毒并分别转染MSCs,按实验需要进行或不进行缺氧无糖无血清缺氧处理6 h。实验分为四组:GFP-LV-MSCsNrf2+/-常氧组(简称 MSCsNrf2+/-常氧组)、GFP-LV-MSCsNrf2-/-常氧组(简称 MSCsNrf2-/-常氧组)、GFP-LV-MSCsNrf2+/-缺氧组(简称MSCsNrf2+/-缺氧组)、GFP-LV-MSCsNrf2-/-缺氧组(简称MSCsNrf2-/-缺氧组)。分别用荧光表达、流式细胞术确定最佳感染复数(Multiplicity of infection, MOI);Western blot法检测各组核蛋白中Nrf2及其下游靶点HO-1的蛋白表达水平; CCK8法、流式细胞术和细胞免疫荧光法检测各组细胞的增殖、凋亡和分化情况;细胞划痕试验观察各组细胞的迁移能力。
　　体内部分:采用结扎左冠状动脉前降支建立大鼠心肌梗死模型,60只大鼠随即均分为溶剂对照组(PBS组)、空载慢病毒组(MSCsNrf2+/-组)和Nrf2沉默组(MSCsNrf2-/-组),建模成功后即刻在心肌梗死交界区不同点注射2×106/0.3ml的细胞,注射等体积 PBS溶液作为对照。在心肌梗死模型建立后不同时间点,采用伊红-苏木素(Hematoxylin Eosin,HE)染色观察细胞移植后心肌病理变化,Masson染色检测心肌组织梗死区胶原纤维改变,TTC染色检测心梗面积,细胞免疫荧光法观察移植细胞存活、增殖和分化情况,并行超声心动图检查,观察心功能各项指标的变化。采用Western-blot法检测各实验组大鼠心肌梗死区Nrf2、HO-1、Bcl-2、Bax和MMP9的蛋白表达水平。
　　结果:
　　体外实验:流式细胞术检测结果显示,所培养的MSCs中CD29、CD90表达阳性而CD45表达阴性,符合MSCs特征。Nrf2 siRNA-EGFP重组慢病毒转染MSCs最佳MOI值为20,并在转染后72小时时绿色荧光蛋白表达最强。采用流式细胞术检测各组细胞凋亡率,结果显示:与其余各组相比, MSCsNrf2-/-缺氧组的细胞凋亡率显著增高(P<0.05)。采用CCK8法检测各组增殖情况和划痕实验检测各组迁移情况,结果显示,与常氧组相比,缺氧组的细胞增殖速率和细胞迁移率均显著下降(P<0.05);与MSCsNrf2+/-缺氧组相比,MSCsNrf2-/-缺氧组的细胞增殖速率和细胞迁移率也显著下降(P<0.05)。细胞免疫荧光检测各组CD31表达情况,结果显示,缺氧不能诱导MSCs分化为成熟内皮细胞,且沉默Nrf2对MSCs内CD31的表达无显著影响。Western bolt检测各组Nrf2核蛋白和HO-1蛋白表达水平,结果显示:与MSCsNrf2+/-常氧组相比, MSCsNrf2+/-缺氧组表达水平明显升高(P<0.05);而与MSCsNrf2+/-缺氧组相比,MSCsNrf2-/-缺氧组表达则显著下降(P<0.05);MSCsNrf2+/-常氧组与MSCsNrf2-/-常氧组组间比较无显著差异(P>0.05)。
　　体内实验: HE、Masson和 TTC染色结果显示,在心肌梗死模型建立后第28天,与MSCsNrf2+/-组相比,MSCsNrf2-/-组的心肌组织病理病变程度较重(P<0.05),梗死面积增大(P<0.05),但其与PBS组相比并无显著差异(P>0.05)。组织免疫荧光结果显示,在心肌梗死模型建立后第7天,与 MSCsNrf2+/-组相比,MSCsNrf2-/-组凋亡蛋白Caspase3表达增加。Western blot结果显示,与MSCsNrf2+/-相比,MSCsNrf2-/-组梗死区中Nrf2、HO-1和Bcl-2蛋白表达下降,Bax、MMP9表达增加,差异有统计学意义(P<0.05);但其与PBS组相比,各蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。超声心动图结果显示,细胞移植后第28天,与MSCsNrf2+/-组相比,MSCsNrf2-/-组中LVDd和LVDs值增大、EF值下降(P<0.05),差异均有统计学意义;但MSCsNrf2-/-组与PBS组两组间各指标比较均无显著性差异(P>0.05)。
　　结论:采用贴壁筛选法可分离获得高纯度的MSCs,且Nrf2 siRAN/LV可成功转染入大鼠MSCs并使Nrf2基因表达显著减少。沉默Nrf2可促进MSCs发生凋亡,降低其缺氧耐受力,且对其分化为成熟内皮细胞无显著影响。沉默 Nrf2可降低体外模拟炎性环境中MSCs的增殖速率和迁移速率,但这可能与Nrf2的抗凋亡作用有关;沉默Nrf2也许并不能直接影响MSCs的增殖和迁移,而是通过降低MSCs的细胞活力从而抑制其增殖和迁移。向心肌梗死大鼠心脏内移植一定数量的MSCs可在一定程度上改善心功能,这与Nrf2在所移植的MSCs中发生核转位密切相关。沉默Nrf2可降低所移植的BMSCs对急性梗死心肌氧化应激环境的耐受能力,且不能显著改善梗死心肌炎性微环境及心肌梗死大鼠的心脏重构和心功能。

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前言

第一部分siRNA沉默Nrf2基因对体外模拟炎性环境中骨髓间充质干细胞生物学特性的影响及潜在机制研究

1材料与方法

1.1主要实验材料

1. 2 实验方法

2结果

2.1 细胞形态

2.2 MSCs表型的鉴定

2.3 MSCs的生长曲线

2.4 MSCs体外细胞损伤模型的建立

2.5缺氧处理MSCs后Nrf2的核转位

2.6缺氧处理后各组Nrf2核蛋白和HO-1的总蛋白表达。

2.7慢病毒转染MSCs后增强型绿色荧光蛋白的表达情况

2.8慢病毒转染MSCs的转染复数确定

2.9慢病毒转染对MSCs表面标记物的影响

3 讨论

4 小结

第二部分siRNA沉默Nrf2基因对骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠急性心肌梗死的影响及潜在机制研究

1 材料与方法

1.1主要实验材料

1.2实验方法

2结果

3 讨论

4 小结

全文结论

参考文献

Nrf2与心血管系统防御

参考文献

致谢

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