创伤弧菌溶血素基因在大肠杆菌中的高效表达和鉴定

摘要

目的：创伤弧菌(Vibrio vulnificus，Vv)自然存在于近海和海湾的海水和海底沉积物中，属低度嗜盐菌。人通过进食生的牡蛎，经胃肠道粘膜或破损的皮肤接触海水而感染创伤弧菌。创伤弧菌感染后病情发展迅速，最终发展为感染性休克、多器官衰竭而死亡，死亡率高达70％。创伤弧菌的致病性与许多毒力因子有关，包括溶血素、脂多糖、荚膜多糖、弹性组织蛋白激酶和金属蛋白激酶等。研究发现胞外溶血素基因(Vibrio vulnificus cytolysin，vvc)是重要的致病因子之一，参与了细菌入侵宿主的毒力机制。本文通过构建创伤弧菌溶血素基因(vvc)的融合表达载体，并实现创伤弧菌溶血素在大肠杆菌中的高效表达，为今后的进一步研究提供依据。 方法：根据GenBank公布的创伤弧菌vvc基因核苷酸序列自行设计了一对引物，并在5’-端与3’-端分别增加BamHⅠ和HindⅢ酶切位点，应用PCR技术从一株创伤弧菌基因组中扩增了vvc基因，PCR产物经BamHⅠ和HindⅢ双酶切回收后，定向插入pET-32a(+)原核表达载体，提取pET32a(+)-vvc重组质粒，进行双酶切并测序，将测定结果与GenBank中已报道的序列进行同源性分析。结果正确后将构建的重组质粒转化于E.coli BL21(DE3)工程菌株中，IPTG诱导表达，表达产物行SDS-PAGE并进行Westernblot鉴定。 结论：从创伤弧菌的总DNA中克隆了胞外蛋白vvc基因，成功地构建了pET32a(+)-vvc重组质粒，并在大肠杆菌中实现了高效表达和鉴定。本研究为进一步深入了解VVC蛋白的生物学活性，以及诊断试剂盒的制备、阐明该菌的致病机制奠定了基础。

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英文文摘

声明

前言

第一部分重组质粒pET32a(+)-vvc的构建和vvc基因的测序

1材料与仪器

2试验方法

3结果与分析

4讨论

5小结

第二部分重组质粒pET32a(+)-vvc在大肠杆菌中的高效表达和鉴定

1材料与仪器

2试验方法

3结果与分析

4讨论

5小结

参考文献

攻读学位期间发表的论文

致 谢

附录