链霉菌Streptomyces sp.S27来源的β-1，3-葡聚糖酶和β-甘露糖苷酶的基因克隆与性质研究

摘要

本研究通过对菌种新颖性和产酶能力评估确定了链霉菌S27（Streptomyces sp.S27）为本实验的研究对象。链霉菌是一种资源丰富的拮抗微生物，在工业、农业和环境科学等方面有着广泛的用途。链霉菌S27分离自新疆吐鲁番盆地的火焰山。 利用生物信息学的方法，对链霉菌来能源的糖苷水解酶16家族的β-1，3-葡聚糖酶序列进行比对设计简并引物，通过简并PCR扩增得到来源于链霉菌S27编码的β-1，3-葡聚糖酶的基因片段，再结合基因组文库筛选和TAIL PCR的方法最终获得基因的全序列并成功地在大肠杆菌BL21（DE3）中得到活性表达。bglS27基因全长1，359bp，编码453个氨基酸，理论分子量42.7kDa。成熟蛋白包含一个糖苷水解酶16家族的催化域，一个短的Gly连接域和一个第13家族的糖基结合域。纯化的重组酶ManS27以内切方式特异性地切割β-1，3-葡聚糖苷键。它在65℃和pH5.5活性最高，热稳定好，其比活和Km值分别为236.0 Umg-1和1．89mg ml-1。抑菌试验表明，BglS27可以抑制产毒素真菌（如：Fusarium Grauunearum，Fusarium crookwellense，Paecilomyces variotii）和致病真菌（Rhizoctonic solani）的生长。BglS27具有的良好性质使其在食品和饲料保藏、植物保护和其它生物技术领域有潜在的应用前景。 根据已知的链霉菌S27来源的β-甘露糖苷酶基因片段序列设计引物，通过筛选链霉菌S27基因组文库的方法克隆得到β-甘露糖苷酶基因manS27。该基因全长2.496bp，编码832个氨基酸和一个终止密码子，理论分子量为92.5 kDa。将manS27以正确阅读框架克隆到表达载体pET-22b（+）上，并在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达。纯化的ManS27酶学性质分析表明，其最适温度为50℃，最适pH值为7.0，比活和Km值分别为35.3 Umg-1和13.75mg ml-1。实验结果表明，ManS27具有转糖基作用。 本研究从链霉菌S27克隆得到β-1，3-葡聚糖酶和β-甘露糖苷酶的基因，通过构建表达载体并转化大肠杆菌获得了表达生物活性产物的重组子，这些重组子的获得为下一步高产商品化菌株的构建及其酶的分子生物学研究奠定了良好的基础，具有一定的应用价值。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章前言

1 β-1，3-葡聚糖酶的研究进展

1.1β-1，3-葡聚糖酶的生理功能

1.2β-1，3-葡聚糖酶来源

1.3 β-1，3-葡聚糖酶的结构

1.4 β-1，3-葡聚糖酶的应用

1.5 β-1，3-葡聚糖酶异源表达研究进展

2β-甘露糖苷酶的研究进展

2.1 β-甘露糖苷酶生理功能

2.2β-甘露糖苷酶来源

2.3 β-甘露糖苷酶转糖基作用

2.4 β-甘露糖苷酶应用

3基因克隆技术的研究进展

3.1构建基因组文库

3.2 Tail-PCR技术

3.3简并PCR技术

4大肠杆菌表达系统的研究进展

5研究的目的和意义

6.实验方案

第二章来源于链霉菌Streptomyces sp.S27的β-1，3-葡聚糖酶的基因克隆与性质研究

1.实验材料

1.1菌株与质粒

1.2引物合成

1.3试剂盒、工具酶和生化试剂

1.4仪器

1.5培养基

1.6常用溶液

2.实验方法

2.1链霉菌S27产酶能力的验证

2.2链霉菌S27基因组DNA的提取

2.4 β-1，3-葡聚糖酶基因bglS27的克隆

2.5原核表达载体pET22b-bglS27的构建

2.6 pET22b-bglS27在大肠杆菌中的表达

2.7重组酶BglS27分离纯化和浓度测定

2.8重组酶BglS27酶学性质测定

2.9重组酶BglS27降解产物的研究

2.10重组酶BglS27抑菌活性的研究

3实验结果

3.1链霉菌S27产酶能力的验证

3.2 β-1，3-葡聚糖酶基因bglS27的克隆

3.3原核表达载体pET22b-bglS27的构建

3.4重组酶BglS27的诱导表达与纯化

3.5重组酶BglS27酶学性质研究

3.6重组酶BglS27底物特异性

3.7重组酶BglS27降解产物分析

3.8重组酶BglS27抑制真菌生长的活性

4讨论

本章小结

第三章来源于链霉菌Streptomyces sp.S27的β-甘露糖苷酶的基因克隆与性质研究

1实验材料

1.1菌株与质粒

1.2引物合成

1.3试剂盒、工具酶和生化试剂

1.4仪器

1.5培养基

1.6常用溶液

2实验方法

2.1 β-甘露糖苷酶基因manS27的克隆

2.2原核表达载体pET22b-manS27的构建

2.3重组酶ManS27的纯化

2.4重组酶ManS27酶学性质测定

2.5重组酶ManS27转糖苷活性测定

3.实验结果

3.1β-甘露糖苷酶基因manS27的克隆

3.2原核表达载体pET22b-manS27的构建

3.3重组酶ManS27的诱导表达与纯化

3.4重组酶ManS27酶学性质研究

3.5重组酶ManS27转糖苷活性测定

4讨论

本章小结

第四章结论

参考文献

硕士在读期间发表论文

致 谢