骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠糖尿病足溃疡及其VEGF表达的实验研究

摘要

目的：建立一种简单、稳定、便于测量的大鼠糖尿病足溃疡模型，初步探讨局部移植异体骨髓间充质干细胞(MSCs)治疗大鼠糖尿病足溃疡的效果及血管内皮生长因子(VEGF)在全身及局部的表达情况。
　　 方法：50只雄性Wistar大鼠随机分为对照组(10只)和造模组(40只)，造模组大鼠高脂喂养后腹腔注射链脲佐菌素(STZ)45mg/kg，对照组注射等量缓冲液。监测两组空腹血糖、体重、饮水量、尿量及股动脉超声多普勒血流学变化。符合血糖≧16mmol/L及多饮、多尿、体重减轻等症状后，将两组大鼠足背部切除一3cm×7cm矩形全层皮肤组织，建立糖尿病足溃疡模型，比较二组溃疡愈合时间。常规采集MSCs，贴壁法分离、培养、纯化大鼠MSCs，取90只雄性Wistar大鼠糖尿病足溃疡模型，随机分为三组，正常对照组(A组，n=30)、骨髓间充质干细胞移植治疗组(B组，n=30)、糖尿病对照组(C组，n=30)。B、C两组溃疡形成后第1天于溃疡周围边缘1cm处四点皮下肉膜层注射移植0.1ml计数后细胞悬液，并同时于造模后第1、4、8天用软件Image-Pro Plus6.0记录三组大鼠的愈合面积、细胞核荧光染色示踪、ELISA法检测外周血VEGF浓度、western-blotting检测测局部VEGF表达强度、病理学观察及免疫组化检测CD34表达。
　　 结果：1.糖尿病造模组40只注射STZ后，有30只大鼠血糖≧16 mmol/ml，并有多饮、多尿、多食、消瘦等症状，一周后行多普勒血流学检查，造模组符合动脉粥样硬化性血流频谱变化，对照组血流频谱正常。2.形成溃疡模型后，造模组平均愈合时间(12.51±1.21天)明显较正常大鼠愈合时间(9.67±0.87天)延迟(P＜0.01)。3.贴壁法体外培养骨髓间充质干细胞，原代大鼠MSCs第9～10天时可见培养瓶底有多量散在的梭型、多角型骨髓间充质干细胞，第12天骨髓间充质干细胞可于培养皿底融合80％～90％，传代后1、2、3代第10天左右可基本融合，第2、3代呈均匀一致的长梭形。4.溃疡形成第1天注射移植MSCs细胞于溃疡周围，移植后1、4、8天行冰冻切片观察，均可见淡蓝色荧光聚集生长于溃疡周围皮下；5.细胞移植后平均愈合面积第4天可见B组(溃疡面积23.62±2.26 mm2)愈合明显较C组(溃疡面积25.50±6.79 mm2)快，但仍慢于A组(20.16±3.68 mm2)；第8天检测A、B、C三组结果同第4天(溃疡面积A组3.64±0.92 mm2，B组7.56±1.91 mm2，C组13.20±1.74 mm2)，B组明显较C组愈合速度快，但仍达不到A组水平。5.VEGF外周血浓度测定为：第4天(A组1.58±0.06μg/L，B组1.53±0.08μg/L，C组1.04±0.05μg/L，p＜0.01)；第8天(A组1.70±0.04μg/L，B组1.50±0.04μg/L，C组1.14±0.07μg/L，p＜0.01)均可见B组浓度低于正常水平，但高于C组。6.局部VEGF表达强度：C组(第1天0.21±0.02，第4天0.24±0.02，第8天0.19±0.02)在1、4、8天均明显低于A(第1天1.04±0.05，第4天1.81±0.06，第8天1.64±0.06)、B组(第1天2.44±0.25，第4天2.86±0.11，第8天0.85±0.06)；B组高于A组；第4天B组显著高于A组，但第8天，B组低于正常水平A组。7.MSCs移植注射后第1、4、8天检测CD34+累积光密度(IOD值)可见A组(第1天0.220±0.031，第4天0.279±0.038，第8天0.394±0.102)较B(第1天0.138±0.01，第4天0.189±0.021，第8天0.361±0.032)、C组(第1天0.142±0.042第4天0.173±0.031第8天0.322±0.016)表达高，第1、4天B、C组无差异，造模第8天，B组较C组表达高，各组内差异均有统计学意义8.病理切片观察可见B组在肉芽生长及表皮覆盖速度明显较C组快，但仍然较A组为慢。
　　 结论：1.通过本实验建立的动物模型，更加符合糖尿病足溃疡的临床、病理生理特点，具有简便、经济、稳定、易于测量等优点。2..骨髓间充质干细胞易于获得，移植后可稳定定居于溃疡局部。3.异体单次移植MSCs可促进糖尿病足溃疡的愈合。其修复机制可能是通过上调了局部、全身外周血VEGF的表达，进而促进了局部微血管的形成，但单次异体移植不足以导致局部VEGF的持续分泌。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

前言

实验一 大鼠糖尿病足溃疡模型的建立

实验二 骨髓间充质干细胞的分离、培养、提纯、鉴定及示踪

实验三 骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠糖尿病足溃疡及VEGF表达

小 结

参考文献

在学期间发表论文

致 谢

附 图