肝癌细胞胰岛素抵抗与耐药性的关系及肝癌多药耐药细胞模型的建立和特性

摘要

目的： 研究人肝癌细胞胰岛素抵抗(Insulin resistance，IR)与药物敏感性的关系；建立肝癌多药耐药(Multidrug resistance，MDR)转基因细胞模型，为探讨肝癌细胞MDR与IR的相关性奠定基础。 方法： 1、体外采用高浓度胰岛素诱导人源肝癌细胞HepG2建立IR细胞模型(Insulin-resistant HepG2，HepG2/IR)，葡萄糖氧化酶-过氧化氢酶(Glucose oxidase-peroxidase，GOD-POD)法测定葡萄糖消耗量，观察HepG2/IR细胞IR持续时间；流式细胞术(Flow cytometry，FCM)检测HepG2/IR细胞胰岛素受体(Insulin receptor，InsR)蛋白表达和P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)表达水平；实时荧光定量PCR检测HepG2/IR细胞InsR及mdrl mRNA水平；MTT比色法检测HepG2/IR细胞对抗癌药物阿霉素(adriamycin，ADM)的敏感性，Annexin V/PI双标记法检测HepG2/IR细胞的凋亡。 2、采用脂质体介导法将含有人多药耐药基因1(mdrl)全长cDNA的真核表达质粒pCI-neo-mdrl导入肝癌HepG2细胞，通过G418筛选出表达mdrl基因的肝癌HepG2细胞(HepG2/mdrl)。倒置相差显微镜观察HepG2/mdrl细胞形态学变化；MTT比色法测定HepG2/mdrl细胞的增殖活性；FCM检测HepG2/mdrl细胞P-gp的表达及ADM的蓄积和排除；实时荧光定量PCR检测HepG2/mdrl细胞mdrl mRNA的表达水平。 结果： 1、胰岛素诱发HepG2发生IR后，HepG2/IR细胞葡萄糖消耗量降低16.61％～41.78％，并呈时间-浓度依赖性，IR维持时间可达48 h；胰岛素诱导HepG2细胞产生抗性的过程中，与HepG2细胞相比，HepG2/IR细胞InsR基因mRNA表达较HepG2细胞下降43.67％，InsR受体表达量降低69.31％；HepG2/IR细胞mdrl mRNA表达增高4.21倍，P-gp表达阳性率增高1.01倍，与细胞葡萄糖消耗量及InsR表达量呈负相关。HepG2/IR细胞对ADM的敏感性降低，较HepG2细胞耐受3.2倍；HepG2/IR细胞对ADM诱导的细胞凋亡抵抗，凋亡效应较HepG2细胞低3.5倍。 2、建立的转基因肝癌多药耐药性HepG2/mdrl细胞的生长速度较HepG2细胞缓慢，倍增时间均为20～22h，形态学上无明显差异；与亲本HepG2细胞相比，HepG2/mdrl细胞mdrl mRNA的表达量增加5.6倍，P-gp表达阳性率增高6.7倍，表达强度(MFI)增加23.03％。HepG2/mdrl细胞中ADM蓄积量仅为HepG2细胞的61.12％，而排出量则为HepG2细胞的192.48％。研究结果证实mdrl基因已成功导入HepG2细胞且能稳定表达，转基因肝癌多药耐药性HepG2/mdrl细胞模型建立成功。 结论： 1、用高浓度胰岛素培养法诱导人源肝癌HepG2细胞，成功建立了胰岛素抵抗模型细胞(HepG2/IR细胞)； 2、胰岛素抵抗肝癌细胞InsR基因mRNA和受体蛋白表达明显降低，耐药基因mdrl及其产物P-gp的表达显著增高；HepG2/IR细胞阿霉素的敏感性降低，耐药性增高，提示肝癌细胞多药耐药性与其胰岛素抵抗性相关联； 3、应用基因转导技术成功建立了肝癌多药耐药细胞模型(HepG2/mdrl细胞)，能够稳定高表达mdrl/P-gP，为进一步探讨肝癌细胞MDR与IR的相关性奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

1胰岛素与胰岛素抵抗

2胰岛素抵抗与肿瘤的关系

3肿瘤多药耐药及多药耐药细胞模型

4胰岛素抵抗与肿瘤多药耐药性

参考文献

第一部分胰岛素抵抗肝癌细胞对抗癌药物的敏感性

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

参考文献

第二部分肝癌转基因多药耐药细胞模型的建立及其特性

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

参考文献

硕士期间完成的科研成果

致谢

附录 英文缩略词