毛细管电泳检测基因突变方法学及其在肺癌中的应用研究

摘要

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，它的发生和基因突变密切相关，所以建立分析基因突变的快速灵敏的检测方法至关重要，目前用于检测基因突变的方法多种多样。 限制性片段长度多态性(RFLP)常与PCR技术结合用于基因突变的检测，结果往往需要借助电泳技术显示，毛细管电泳(CE)分析方法操作简单、灵敏度高，在基因突变检测领域得到了广泛应用。本论文分成两部分对CE检测基因突变进行研究。 第一部分首先通过系统考察筛分介质聚环氧乙烷(PEO)(Mr=4500000)在未涂层和共价涂层的毛细管中分离不同大小和范围DNA片段的能力，建立一套适用于不同大小的双链DNA分离体系。系统研究PEO浓度、pH、电泳温度和电压等因素对双链DNA分离的影响。 结果表明未涂层的毛细管对pUC19 DNA/MspⅠ(HpaⅡ)DNA Marker的分离效果不佳；在共价涂层条件下，能很好的分离pUC19 DNA/MspⅠ(HpaⅡ)DNAMarker。建立的这套双链DNA片段分离体系在共价涂层条件下最终可以达到同时分离30bp～600bp的双链DNA，符合RFLP分析基因突变的要求。 以pUC19 DNA/MspⅠ(HpaⅡ)Marker标准DNA片段为研究对象，分子量为4500000的PEO与之前实验室考察的分子量为300000的PEO相比，分离效果相对较差。因此以PEO(Mr=300000)为筛分介质(浓度为3.0％，pH8.2，分离电压为15kV，电泳温度为15℃)分析临床76例肺癌及癌旁正常组织p53基因248、249位密码子和H-ras、K-ras基因12位密码子的限制性片段长度多态性。肺癌病理分型一般为非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)。结果76个样品中，38个正常组织中未检测到相关的基因突变，而在肺癌组织中检测到p53基因在NSCLC和SCLC中突变率分别为75.86％和77.78％；ras基因在NSCLC和SCLC中突变率分别为51.72％和0。并且在10min内检测到了基因的突变情况。 第二部分用已经建立的毛细管电泳分离体系，以甲基纤维素(MC)为筛分介质(浓度2.0％，pH值8.0，电场强度为7.5kV，毛细管温度25℃)分析76例肺癌及癌旁正常组织p53基因第249位密码子的限制性片段长度多态性。 运用CE与聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)两种方法对肺癌及癌旁正常组织p53基因第249位密码子点突变进行检测，并对其检测结果进行比较。RFLP-CE和RFLP-PAGE检测NSCLC突变率分别为31.03％和20.69％，即RFLP-CE检测基因突变率明显高于RFLP-PAGE。CE-RFLP检测SCLC和正常肺组织则均无1例点突变，而且在NSCLC中p53基因第249位密码子突变与肺癌分化程度无关。并且在20min内检测到了基因的突变情况。 建立的CE方法学适于分离小于600bp的DNA片段。CE在检测肺癌基因突变方面检测时间短，且检出率高，初步建立了快速、高分辨率诊断肺癌的方法。

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文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

引 言

第一部分筛分介质PEO分离DNA片段的研究

第一节未涂层和共价涂层条件下PEO对不同DNA片段的分离

前言

1实验材料

2实验方法

3实验结果

4讨论

第二节筛分介质PEO分析p53基因和ras基因

前言

1实验材料

2实验方法

3实验结果

4讨论

第二部分筛分介质MC分析p53基因第249位密码子

前言

1实验材料

1.1实验材料

1.2仪器设备

1.3主要试剂

2实验方法

2.1组织DNA提取，引物设计及PCR扩增

2.2 RFLP-PAGE方法检测PCR产物

2.3 RFLP-CE方法检测PCR产物

3实验结果

3.1 RFLP-PAGE结果

3.2 CE分离Marker结果

3.3 CE检测样品结果

3.4病理分型中p53基因第249位密码子点突变

3.5病理分级中p53基因第249位密码子点突变

4讨论

论文总结

参考文献

科研成果

科研项目情况

致 谢