无胶筛分毛细管电泳检测基因突变的方法学研究及其在胃癌中的应用

摘要

基因突变与肿瘤发生有着较高的相关性，所以探索研究新的、灵敏度高的检测基因突变的方法是相关领域专家共同关注的热点问题，也是交叉学科。目前几乎所有的基因突变检测都是建立于PCR基础之上，操作简便准确率高的基因分析技术限制性片段长度多态性(RFLP)常与其结合用于基因突变的检测，但结果往往需要借助电泳技术显示，而传统的平板凝胶电泳分辨率低、分析时间长，不能很好的用于各种长度DNA片段尤其是小片段的多态性分析。随着与高效毛细管电泳技术(CE)联合在分子生物学中的广泛应用，使得RFLP-CE具备了检测灵敏度高、分离度高和检测效率高的特点。建立高效的检测基因突变方法，可为临床肿瘤的准确诊断和预警提供更为科学的技术和方法。本论文以此为目的探索建立了一套适用于RFLP技术的毛细管电泳分析分离体系用于临床胃癌组织基因突变检测，系统考察了毛细管电泳体系中不同筛分介质分离不同大小和范围的DNA片段的能力。 本论文共分为三部分，第一部分毛细管电泳在基因突变及多态性分析中的研究背景，第二部分是毛细管无胶筛分电泳中不同筛分介质对DNA分离的方法学研究，第三部分是选择合适的毛细管电泳分离体系联合RFLP检测胃癌组织中p53基因和ras基因点突变，并探讨p53基因和ras基因点突变在胃癌发生的作用和地位。 第一部分研究背景介绍，主要综述了胃癌发生相关基因p53和ras基因及异常基因检测方法研究进展，毛细管电泳研究背景主要集中在筛分机理、筛分介质、毛细管涂层技术和其他一些影响电泳的因素以及毛细管电泳在基因突变及多态性分析方面的应用进展等。 第二部分毛细管无胶筛分电泳(NGS-CE)中不同筛分介质对DNA分离的方法学研究，目的是通过系统考察不同筛分介质分离不同大小和范围DNA片段的能力，建立一套适用不同大小的基因双链分离体系。首先应用甲基纤维素(MC)为筛分介质并结合本实验室成熟的毛细管共价涂层技术，考察了对pUC19 DNA/MspⅠ(HpaⅡ)DNAMarker、PBR322/BsuRI DNA Marker和FastRulerTM DNA Ladder的分离情况，系统研究了MC浓度、温度、分离电压、筛分介质pH等因素对双链DNA分离的影响，结果表明MC是一种良好的筛分介质，能成功分离上述三种不同的DNA片段；其次，应用具有动态涂层能力的分子量相对较小的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚环氧乙烷(PEO)为筛分介质在空毛细管柱中考察了对pUC19 DNA/Msp Ⅰ(HpaⅡ)DNA Marker、PBR322/BsuRI DNA Marker和FastRulerTM DNA Ladder的分离情况，结果表明PVP分离puC19 DNA/MspⅠ(HpaⅡ)DNA Marker、PBR322/BsuRI DNA Marker的效果不佳，而分离FastRulerTM DNA Ladder能够获得很高的分离度；PEO能很好的分离pUC19DNA/MspⅠ(HpaⅡ)DNA Marker和FastRulerTM DNA Ladder。建立的这一套双链DNA片段分离体系最终可以达到同时分离10bp～600bp的双链DNA，符合RFLP分析基因突变的要求。 第三部分应用已经建立的无胶筛分毛细管电泳分离体系与PCR-RFLP技术相结合用于胃癌组织p53基因175位、245位密码子和H-ras、K-ras基因12位密码子突变情况的同时检测。提取了59例胃癌患者及癌旁正常组织的基因组DNA，经测定DNA浓度适中，纯度较好。利用PCR扩增出相应的目的片段，使用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒纯化PCR产物，排除了PCR产物中离子和引物二聚体对后续研究的干扰，扩增的目的片段中，有的片段较小不能进行纯化。相应的限制性内切酶切割纯化的PCR产物，然后应用毛细管电泳分离体系(筛分介质为2.0％MC，pH8.0，分离电压7.5kV，电泳温度25℃)分析临床59例胃癌患者p53和ras基因扩增产物的限制性片段长度多态性。20min内检测了各个基因不同位点的突变情况。初步建立了快速、高分辨率诊断胃癌的方法。结果显示胃癌的p53基因点突变率为20.51％(8/39)，ras基因点突变率为11.11％(5/45)。其中p53基因175位密码子有5例发生突变(5/39，12.82％)，245位密码子有3例发生突变(3/39，7.69％)，H-ras基因有1例发生突变(1/45，2.22％)，K-ras基因有4例发生突变(4/45，8.89％)，只有在2例中同时发现p53和ras基因发生突变。经统计学处理，p53基因突变和发生部位无明显相关性，ras基因的突变主要集中在胃体和胃底贲门。p53和ras基因在胃癌和胃癌组织不同病理分型中的突变率结果显示，p53基因突变在部分胃癌的发生中起着较重要的作用，ras基因突变可能在胃癌的发生中作用不明显。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

第一章毛细管电泳在基因突变及多态性分析中的研究背景

第一节胃癌发生相关基因及其检测方法研究进展

1.1.1 p53基因

1.1.2 ras基因

1.1.3其它基因

1.1.4基因异常检测方法简介

第二节无胶筛分毛细管电泳技术研究进展

1.2.1筛分机理

1.2.2筛分介质

1.2.3毛细管涂层技术

1.2.4其他因素

第三节NGS-CE在基因突变及多态性分析中的应用

1.3.1限制性片段长度多态性分析

1.3.2单链构象多态性分析

1.3.3高效毛细管电泳-限制性内切酶指纹分析法

1.3.4其他基因分析方法

1.3.5 NGS-CE与各种基因突变检测技术联用在肿瘤相关基因研究中的应用

1.3.6结语

参考文献

第二章毛细管无胶筛分电泳中不同筛分介质对DNA分离的方法学研究

第一节共价涂层下甲基纤维素对不同DNA片段的分离研究

2.1.1前言

2.1.2实验部分

2.1.3结果与讨论

第二节动态涂层下聚乙烯吡咯烷酮(PVP)对不同DNA片段的分离研究

2.2.1前言

2.2.2实验部分

2.2.3结果与讨论

第三节动态涂层下聚环氧已烷(PEO)对分离不同DNA片段的研究

2.3.1前言

2.3.2实验部分

2.3.3结果与讨论

本章小结

参考文献

第三章NGS-CE-RFLP检测胃癌组织中p53基因和ras基因点突变

3.1实验部分

3.1.1主要仪器与试剂

3.1.2实验方法

3.2结果和讨论

3.2.1基因组DNA提取结果分析

3.2.2 PCR扩增结果

3.2.3 PCR扩增产物纯化结果

3.2.4 p53基因突变检测

3.2.5 ras基因突变检测

3.2.6 p53和ras基因在胃癌中的突变率

3.2.7不同部位胃癌的p53和ras基因突变率

本章小结

参考文献

论文总结

在学期间研究成果

致谢