新型咪唑并[1，2-α]吡啶化合物(TIPs)诱导人肝癌细胞HepG2自噬性死亡的研究

摘要

目的： 探讨新型咪唑并[1，2-α]吡啶类化合物：7-(4-甲氧基苯基)-5，8α-二苯基-1，2，3，7，8，8α-六氢咪唑[1，2-α]吡啶(7-(4-methoxyphenyl)-5，8α-diphenyl-1，2，3，7，8，8α-hexahydroimidazo[1，2-α]pyfidine，TIP-6)对人肝癌细胞HepG2的抗肿瘤活性的机理及对正常肝细胞L02的影响。 方法： 体外培养细胞，MTT法和台盼蓝染色法测定TIP-6对细胞的增殖活性，计算IC50值；相差显微镜观察TIP-6作用受试细胞后形态学的改变；流式细胞术检测TIP-6作用细胞后对细胞周期的影响；吖啶橙荧光染色观察TIP-6处理后细胞的自噬泡；透射电镜观察受试细胞亚显微结构；Annexin V/7-AAD和DAPI染色以及DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡；FITC标记细胞免疫化学法测定核转录因子NF-κB的表达。 结果： 在体外实验中，TIP-6对不同细胞株的细胞毒作用有明显差异，其中对HepG2细胞株作用24、48、72小时的IC50分别为138.6、88.6、52.5μmol/ml；对L02细胞株相应的数值分别为142.5、93.3、59.1μmol/ml；台盼蓝拒染的结果表明TIP-6对这两种细胞的增殖均有抑制作用，对HepG2的抑制要强于对L02的抑制。相差显微镜观察发现，随着化合物作用时间以及浓度的增加，HepG2细胞中的空泡数目逐渐增多；PI染色的流式细胞术检测发现TIP-6使细胞阻滞在G2/M期；Annexin W7-AAD、DAPI染色及DNA琼脂糖凝胶电泳的结果均说明TIP-6并不是通过诱导细胞凋亡而抑制细胞的增殖；通过对吖啶橙荧光染色及透射电镜的结果分析发现TIP-6可以诱导细胞发生自噬性细胞死亡，且HepG2比L02细胞更敏感；FITC标记的细胞免疫化学结果显示，经TIP-6处理后，随着化合物浓度的增加，细胞中核转录因子NF-κB表达上升。 结论： TIP-6在体外可以有效的抑制HepG2和L02细胞的增殖，使细胞停留在G2/M期，其抑制细胞增殖的主要途径是诱导细胞发生自噬性死亡，而不是凋亡机制，其作用机理很可能是依赖NF-κB信号通路的调节。此外TIP-6对L02的增殖抑制作用要小于HepG2，提示TIP-6具有潜在的抗肿瘤先导化合物活性。这种作用的分子机理有待更深入的研究。

目录

文摘

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论文说明：缩略词表

声明

前言

1.自噬性细胞死亡方式的研究现状

1.1自噬的过程及形态特征

1.2自噬的分类

1.3自噬的功能

1.4自噬作用的分子机制

2.自噬与凋亡

3.自噬与肿瘤

3.1自噬对肿瘤的保护作用

3.2自噬对肿瘤的抑制作用

4.NF－κB与肿瘤

5.咪唑并[1,2-a]吡啶类化合物生物活性研究现状

6.研究目的

材料与方法

1.材料

1.1受试化合物

1.2受试细胞株

1.3试剂

1.4仪器

2.方法

2.1细胞培养

2.2化合物配制及保存

2.3咪唑并[1，2-a]吡啶类系列化合物对肿瘤细胞增殖抑制实验

2.4 TIP-6对HepG2细胞形态学改变的观察

2.5细胞凋亡的检测

2.6 TIP-6诱导HepG2细胞自噬实验

2.7核转录因子NFκB的检测

2.8统计学处理

结果

1.受试化合物对几种细胞的抑制效应

1.1受试化合物的选定及受试细胞的筛选

1.2 TIP-6对HepG2和L02细胞增殖的抑制

2.TIP-6诱导HepG2细胞空泡化的形成

3.TIP-6未引起HepG2细胞凋亡

3.1 TIP-6引起HepG2及L02细胞G2/M期阻滞

3.2 TIP-6处理HepG2细胞后没有凋亡产生

4TIP-6诱导HepG2细胞自噬现象的观察

4.1TIP-66促进自噬泡的形成

4.2自噬体抑制剂3-MA对TIP-6诱导细胞自噬现象的抑制

4.3 TIP-6处理后细胞自噬现象的透射电镜观察

5.TIP-6引起NFκB表达量的上调

讨论

1.新型咪唑并[1，2-a]吡啶类化合物对受试细胞敏感性不同

2.TIP-6对HepG2的增殖抑制不经过诱导细胞凋亡途径

3.自噬性细胞死亡是TIP-6诱导HepG2增殖抑制的重要机理

4.NF-kB参与了自噬性细胞死亡

结论

参考文献

在学期间发表论文及参与课题

致谢