利用启动子探针载体分离与筛选Arthrobacter sp.A3冷诱导启动子

摘要

转录是生物体最重要的生命活动过程之一，启动子作为基因转录与调控中的核心元件，直接影响生物体性状的形成及其对外界环境的适应性。Arthrobactersp.A3是从乌鲁木齐河源1号冰川永久冻土中分离的一株具有较高G+C比例的革兰氏阳性菌，其生长环境极端。为了深入研究并阐明其抗逆机制，本实验以Arthrobacter sp.A3为材料进行了冷诱导启动子筛选的研究，构建了启动子探针载体，筛选了9个冷诱导启动子并对其强度进行了测定，为后续的功能研究奠定基础。主要研究结果如下：
　　 (1)以pART2质粒为基础，去除pART2质粒的启动子片段，3种阅读框架不同的Amp-gfp融合基因作为报告基因，构建了能在Arthrobacter sp.和E.coli中正常复制的启动子探针质粒pART2-SP-Amp-gfp。
　　 (2)采用CTAB法提取节杆菌Arthrobacter sp.A3基因组DNA，用Sau3AI进行部分酶切后与BamHI酶切并去磷酸化的探针质粒pART2-SP-Amp-gfp连接构成启动子探针质粒库，将质粒库电击转化入节杆菌Arthrobacter sp.A3，共得到约900000个转化菌落。
　　 (3)重组质粒pET-28-gfp的构建。利用其诱导表达GFP-His6融合蛋白，并经His亲和柱纯化得到了重组蛋白。以纯化的融合蛋白GFP-His6作为抗原，通过免疫家兔制备多克隆抗体，并利用Western Blot和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗体的灵敏度和特异性。结果表明，GFP多克隆抗体效价均达到1:100000以上，将蛋白-Sepharose CL-6B与血清杂交，得到纯化的GFP抗体片段。
　　 (4)应用全波长酶标仪初步筛选挑出9个低温胁迫下表达量较高的冷诱导启动子，之后应用Western Blot检测低温处理下GFP在Arthrobacter sp.A3体内的表达，进而验证启动子的强度，并通过PCR扩增发现冷诱导启动子大小约为200bp～400bp。
　　 综上所述，本研究构建了pART2-SP-Amp-gfp启动子探针质粒，获得了节杆菌启动子筛选菌株库。体外表达并纯化了GFP融合蛋白，制备了多克隆抗体。应用全波长酶标仪和GFP抗体筛选并验证9个冷诱导启动子，并发现冷诱导启动子大小约为200bp～400bp。以上的研究结果为进一步揭示基因表达调控机制奠定了良好的基础，从而更好的阐释冻土微生物低温生存的抗逆机理，具有一定的理论意义和应用前景。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写词表

声明

第一章前言

一.启动子概述

1.启动子的概念及特征

2.启动子的结构

3.启动子分类

4.基因启动子克隆方法

5.启动子研究意义与展望

二.低温微生物概述

1.低温微生物概念

2.低温微生物冷适应机制

3.低温微生物的应用

三.研究目的和技术路线

第二章启动子探针载体的构建

1实验材料

1.1菌株和质粒

1.2 PCR引物

1.3主要试剂及工具酶

1.4实验试剂配置

1.5主要实验仪器

2实验方法

2.1菌种的培养

2.2载体构建

3结果与分析

3.1构建以pART2质粒为基础的缺失启动子载体pART2-SP

3.2 Amp-gfp融合基因PCR扩增

3.3启动子探针载体pART2-SP-Amp-gfp的构建

4小结与讨论

第三章启动子片段的筛选

1实验材料

1.1菌株

1.2质粒

2实验方法

2.1菌种的培养

2.2节杆菌基因组DNA提取

2.3酶切节杆菌基因组DNA和启动子探针质粒pART2-SP-Amp-GFP

2.4 DNA随机片段与启动子探针质粒pART2-SP-Amp-gfp酶切去磷酸化产物的连接

2.5启动子筛选文库电转化节杆菌

3结果与分析

3.1节杆菌Arthrobacter sp.A3基因组DNA随机片段的获得

3.2含节杆菌基因组DNA随机片段启动子探针质粒库的构建

3.3节杆菌启动子筛选菌株库的获得

4小结与讨论

第四章 GFP抗体制备和启动子强度测定

1实验材料

1.1菌株

1.2动物材料

1.3质粒

1.4 PCR引物

1.5实验试剂配置

2实验方法

2.1原核表达载体的构建

2.2蛋白的表达与纯化

2.3抗体制备

2.4 ELISA检测

2.5抗体纯化

2.6全波长酶标仪检测

2.7 Western Blot

3结果与分析

3.1 GFP-His6融合蛋白的诱导表达

3.2 GFP-His6融合蛋白的纯化

3.3抗体的制备

3.4 ELISA检测抗体效价

3.5 GFP多克隆抗体纯化

3.6全波长酶标仪初筛

3.7转化子Western Blot验证结果

3.8冷诱导启动子序列的扩增

4小结与讨论

参考文献

在读期间的科研成果

致谢