N-糖基化对Aspergillus niger 963植酸酶phyA2酶学性质的影响

摘要

糖基化(Glycosylation)是真核细胞蛋白质翻译后修饰的方式之一，对于蛋白质的结构和功能具有重要的影响。曲霉来源的植酸酶是一种重要的磷酸酯酶，属于组氨酸酸性磷酸酶家族(EC.3.1.3.2)，具有典型的该家族植酸酶活性位点保守序列RHGARYP。研究表明，这类植酸酶都是糖蛋白，氨基酸序列中存在10个左右的糖基化位点(N-X-T/S)，必须经过糖基化修饰才具有生物学功能，但这种修饰对于植酸酶蛋白的意义及其不同的糖基化位点在催化反应中扮演的角色目前尚不清楚。本研究中我们利用Megaprimer PCR介导的基因定点突变技术，构建了植酸酶phyA2基因两个N-糖基化突变体，来研究不同位点糖基化修饰的缺失对植酸酶蛋白的影响。主要研究结果如下：
　　 (1)以已克隆的黑曲霉Aspergillus niger963的植酸酶phyA2基因为模板，利用Megaprimer PCR介导的定点突变技术在核酸水平上成功地实现了两个N糖基化位点的诱变，并构建了毕赤酵母表达载体pPIC9-N87Q和pPIC9-N102Q。转化酵母工程菌株GS115，在发酵罐水平上成功表达出了两个重组蛋白。对重组蛋白进行SDS-PAGE检测和Western-blotting免疫印记分析，发现突变体蛋白表观分子量降低了约10kD左右。
　　 (2)对野生型和突变体蛋白酶活性的最适温度及其热稳定性进行了研究，结果表明：野生型植酸酶phyA2、突变体N87Q和N102Q的最适温度都在50℃左右，而与野生型相比，突变体N87Q的酶活在45℃～50℃保持一个相对较高的水平。60℃处理1h后，N87Q剩余约50％的酶活性，与野生型(WT)相比稳定性降低了约20％。N102Q处理10min后，剩余约10％的酶活性，15min后完全丧失活性。70℃处理2min后，野生型WT和突变体N87Q剩余80％左右酶活，而N102Q活性则迅速降低到25％，其后它们的酶活基本保持不变。80℃处理2 min后，突变体和野生型酶活迅速降低到一个较低的水平，4min又升高约10％，其后基本保持在一个相对稳定水平。且N102Q随着处理温度的升高，稳定性反而增强。
　　 (3)对野生型和突变体蛋白最适pH和pH稳定性研究发现：突变体N87Q与野生型WT最适pH基本一致，在pH2.0和pH6.0处出现两个峰，而N102Q峰值出现在pH2.5和pH6.0，但pH2.5处的酶活力明显降低。pH稳定性研究表明：与野生型相比，N87Q稳定性变化不大，在整个pH范围内均保留了约70％的酶活，而N102Q在pH＜3的环境下酶活损失约50％，而在pH＞8的环境下完全失活。
　　 (4)金属离子、EDTA和SDS对突变体和野生型酶活的影响差异不大。其中1mmol/L的Fe2+、Fe3+、Ca2+、Co2+、Mn2+、K+和EDTA对酶具有显著地激活作用，而Mg2+、Zn2+、Cu2+对酶促反应具有极强的地抑制作用，Ag+轻微的抑制了酶促反应，而作为较强变性剂的SDS对酶活的影响反而不大。
　　 (5)突变体和野生型的比活，酶促反应动力学常数Km和Vmax基本没有差异。比活=100,000IU/mg左右，Km=0.435mmol/L,Vmax=3,547,357.218IU/mg.min。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略表

声明

第一章前言

1植酸酶的研究进展

1.1植酸酶的来源和性质

1.2植酸酶的基因及其蛋白结构

1.3植酸酶的催化机制

1.4植酸酶基因工程与蛋白质工程

2毕赤酵母表达系统

2.1毕赤酵母表达系统的组成

2.2毕赤酵母表达系统的特点

3糖生物学研究进展

3.1糖基化修饰的分类和机制

3.2蛋白质糖基化修饰的研究方法

3.3植酸酶蛋白的糖基化研究

4本研究的目的和意义

第二章实验材料与方法

1实验材料

1.1菌株与质粒

1.2引物合成和测序

1.3试剂盒、工具酶和生化试剂

1.4溶液

1.5培养基

1.6实验仪器

2实验方法

2.1 phyA2植酸酶N糖基化位点预测及其确认

2.2植酸酶phyA2基因的定点突变

2.3突变基因真核表达载体构建

2.4植酸酶活性的测定

2.5突变phyA2基因在毕赤酵母中的表达

2.6表达产物的SDS-PAGE检测和Western-blotting免疫印记分析

2.7野生型与突变植酸酶酶学性质的研究

第三章 实验结果

1植酸酶phyA2糖基化位点预测及其确认

2植酸酶phyA2基因的定点突变

3突变基因真核表达载体构建

3.1真核表达载体构建过程

3.2真核表达载体的鉴定

4植酸酶活性的测定

4.1标准曲线的绘制

5突变体植酸酶基因在毕赤酵母中的表达

5.1线性化质粒电击转化毕赤酵母

5.2具有植酸酶活性的转化子的筛选

5.3重组毕赤酵母在发酵罐水平的诱导表达

5.4表达产物的SDS-PAGE检测和Western-blotting免疫印记分析

6野生型及其突变体植酸酶酶学性质的研究

6.1野生型及其突变体植酸酶的最适温度

6.2野生型及其突变体植酸酶的热稳定性研究

6.3野生型与突变体植酸酶的最适pH值

6.4野生型及其突变体植酸酶的pH稳定性研究

6.5金属离子及相关化学试剂对野生型及其突变体酶活的影响

6.6野生型及其突变体植酸酶比活的测定

6.7野生型及其突变体植酸酶Km和Vmax的测定

第四章讨论

第五章结论

参考文献

攻读学位期间公开发表的论文

致谢