心脏干细胞源exosomes传递circHIPK3修复梗死后心肌及血管的实验研究

摘要

研究背景及目的: 干细胞移植治疗急性心肌梗死（Acute myocardial infarction， AMI）已成为全球研究的新趋势。心脏干细胞（Cardiac Stem Cells，CSCs）具有再生修复梗死心肌，促进新生血管形成，从而降低心肌梗死后梗死面积，改善梗死区域微循环作用，因此被认为在治疗 MI 方面具有强大的潜力。然而，CSCs移植治疗MI仍遇到一些瓶颈问题，即CSCs移植至心肌梗死后恶劣微环境中干细胞存活力极低，分化增殖能力受抑制，不能有效的达到受损心肌再生修复的作用，因此目前认为CSCs主要通过旁分泌机制，改善局部心肌梗死微环境，促进心肌细胞存活及局部血管新生发挥作用。外泌体（Exosomes）是纳米级的膜性封闭囊泡，其内包含多种蛋白质和核酸,成为细胞间传递信息的关键中介，而外泌体主要通过非编码RNAs发挥效应，其中circRNAs因具有更好保守性，成为目前研究的热点。随着研究的深入，近来发现circRNAs中circHIPK3具有心脏保护及再生新生微血管的作用。现已研究证实circHIPK3可促进糖尿病视网膜血管的生成。另有研究报道过表达circHIPK3可抑制膀胱癌细胞的迁移、新生血管形成。那么circHIPK3能否促进急性心肌梗死后梗死区域新生血管形成，改善梗死区域微循环，促进梗死区域心肌的修复能力，降低心肌梗死面积？这些问题目前尚未报道。因此，本研究拟探讨心脏干细胞源exosomes可通过传递circHIPK3再生修复梗死后心肌及血管网络，为心脏干细胞的非细胞治疗奠定基础。 第一部分 方法：（1）获取3-4周龄SD大鼠左心耳，利用酶消化法联合MACS法体外分离、培养及分选c-kit+CSCs，传代培养。MACS分选后获取c-kit+CSCs的鉴定：采用流式细胞术鉴定CSCs纯度，采用免疫荧光观察CSCs中C-kit的表达。（2）采用UC法提取c-kit+CSCs来源的Exosomes，利用BCA试剂盒测定Exosomes的浓度。c-kit+CSCs来源Exosomes的鉴定：透射电子显微镜（TEM）观察Exosomes的形态大小；纳米粒子追踪分析（NTA）检测Exosomes的粒径大小及分布范围；Western blot检测Exosomes表面标记蛋白CD9、CD63、HSP70的表达。（3）以慢病毒为载体体外转染过表达 circHIPK3、沉默 circHIPK3 及慢病毒载体至c-kit+CSCs，感染预实验分为四组：①完全培养基，加病毒感染；②含 5ug/ml polybrene的完全培养基，加病毒感染；③Enhance Infection Solution，加病毒感染；④含5ug/mlpolybrene的Enhance Infection Solution，加病毒感染。每组设置1,10,100不同梯度的感染复数（MOI），慢病毒感染4天后，荧光显微镜观察荧光表达情况，以此确认 c-kit+CSCs 的转染条件和转染效率。（4）实验分组：①Control组：不予任何处理的c-kit+CSCs来源Exosomes；②LV-exo组：空载体慢病毒转染 c-kit+CSCs 来源 Exosomes；③LV-circ-exo 组：携带过表达 circHIPK3基因慢病毒载体转染c-kit+CSCs并提取其exosomes；④LV-SiR-circ-exo组：携带沉默circHIPK3基因慢病毒载体转染c-kit+CSCs并提取其Exosomes；以RT-PCR分别检测各组细胞来源Exosomes中circHIPK3的表达量。（5）40只SD大鼠，体重约200-250g，分为2组：假手术组（Sham组）和心肌梗死模型组（MI组）。Sham 组在气管插管呼吸机辅助通气下仅开胸，不结扎左冠状动脉前降支，而MI 组在气管插管呼吸机辅助通气下开胸结扎左冠状动脉前降支。判断心肌梗死模型是否建立成功，冠状动脉结扎前后行心电图检查，术后4周行超声心动图检查，术后4周取心脏组织制成石蜡切片行HE染色和Masson染色观察心肌梗死情况。 结果：（1）利用酶消化法体外分离培养的原代CSCs大小形态均一，24h后即可贴壁，呈长三角形及多角形生长，折光率高。3 天后可见少量细胞贴壁生长，杂细胞相对较多。5天后可见大部分细胞贴壁尚好，呈长三角形及多角形生长，细胞开始扩增，杂细胞较前减少，可见少量细胞融合。7-8天后细胞形态均一，融合50%-60%左右。10天后铺满整个瓶底，扩增速度明显加快，形态无明显变化，可见80%-90%细胞融合。MACS 分选后获得 CSCs 镜下立即观察可见小圆形或椭圆形且折光率较高的目的细胞，其间可见散在磁珠。1 天后可见少量呈三角形或多角形细胞贴壁生长，部分表面结合有折光率较高的磁珠。3 天后细胞扩增速度明显增加，形态仍呈三角形或多角形，细胞密度达50%左右。5天后细胞继续增殖，形态未见明显变化，细胞融合可达80%-90%。MACS分选后获取的c-kit+CSCs经流式细胞术鉴定结果显示，CSCs表达CD34约0.40%，表达CD45约1.28%，而表达c-kit的CSCs达91.62%，免疫荧光观察结果显示CSCs表达c-kit分子达90%以上。（2）BCA试剂盒测定Exosomes的浓度为2.77mg/ml。采用TEM、NTA及Western blot对Exosomes进行鉴定，结果显示，TEM观察到大小不一、圆形或类圆形的囊状小泡，外见脂质双层膜包裹，中间可见光亮区；NTA检测Exosomes的粒径大小约为93.6nm；Western blot检测Exosomes的表面标记蛋白CD9、CD63及HSP70均呈阳性表达。（3）以慢病毒为载体体外转染过表达circHIPK3、沉默circHIPK3及慢病毒载体至c-kit+CSCs，免疫荧光观察结果显示，c-kit+CSCs在完全培养基中容易被感染，感染4天后MOI为100时就能达到90%以上的感染效率。因此，以完全培养基和MOI值为100作为转染条件满足后续实验的需求。（4）RT-PCR分别检测各组细胞来源Exosomes中circHIPK3的表达量，结果显示，Control组与 LV-exo组间无明显统计学意义，与Control组相比，LV-circ-exo组中circHIPK3表达量显著增高（P＜0.01），而LV-SiR-circ-exo组中circHIPK3表达量显著降低（P＜0.01）。（5）MI组SD大鼠手术成功率 80%，术后大鼠精神状态萎靡、反应迟钝，活动减弱，毛发稀疏无光泽，呈黄白色，呼吸频率增快、变浅，进食量明显减少。左冠状动脉结扎后心电图提示I、II肢体导联ST明显抬高； MI模型术后4周行超声心动图检查，MI组左心室腔扩大，左心室壁节段性运动减弱或消失，梗死区域局部室壁变薄，LVEF值和LVFS值较Sham组均明显降低（P＜0.01），LVSd值和LVDd值较假手术组明显增大（P＜0.01）； MI模型术后4周行HE染色，MI组心肌细胞排列紊乱，轮廓模糊，肌纤维增粗变性、坏死，正常心肌细胞由纤维组织替代；Masson染色结果显示，MI组可见大量染成蓝色的胶原纤维，梗死周边区域可见少量呈红色的正常心肌组织。 结论：（ 1 ）利用酶消化法联合 MACS 分选获得纯度高且生长状态良好的c-kit+CSCs，符合其细胞形态和特征。（2）UC法提取的Exosomes浓度较高，经TEM、NTA及Western blot鉴定，符合Exosomes的形态和特征。（3）以慢病毒为载体可成功将circHIPK3转染至c-kit+CSCs内，在完全培养基中MOI值为100时就能达到90%以上的转染效率，满足后续实验的需求。（4）气管插管呼吸机辅助通气下结扎左冠状动脉前降支，可以成功制备MI大鼠模型，为后续实验做准备。 第二部分 方法：(1)用100ul 浓度为1ug/ml DiI工作液标记UC法提取转染后c-kit+CSCs来 源的新鲜Exosomes，MI模型建立成功后局部注射至心肌梗死局部区域。(2)实验分为五组：①假手术组（Sham组），仅开胸，未结扎左冠状动脉前降支；②心肌梗死对照组（Control组），心肌梗死区域局部注射PBS液；③转染慢病毒载体c-kit+CSCs来源Exosomes组（LV-exo组），心肌梗死区域局部注射转染慢病毒载体至c-kit+CSCs来源Exosomes；④转染携带过表达circHIPK3基因慢病毒载体c-kit+CSCs来源Exosomes组（LV-circ-exo组），心肌梗死区域局部注射转染携带过表达circHIPK3基因慢病毒载体至c-kit+CSCs来源Exosomes；⑤转染携带沉默circHIPK3慢病毒载体c-kit+CSCs来源Exosomes组(LV-siR-circ-exo组)，心肌梗死区域局部注射转染携带沉默circHIPK3基因慢病毒载体至c-kit+CSCs来源Exosomes。各组大鼠术前、术后7天、术后14天及术后28天行超声心动图检查比较各组间LVEF值、LVFS值、LVDd值及LVSd值；MI模型术后4周处死大鼠取出心脏组织制成冰冻切片，免疫荧光观察心肌内Exosomes-DiI的内化情况；TTC染色观察比较各组间心肌梗死面积；HE染色观察比较各组间心肌纤维化面积；Masson染色观察比较各组间心肌梗死面积；免疫组织化学观察比较各组间新生微血管的密度和数量。 结果：（1） DiI 标记的 Exosomes 注射至心肌梗死局部区域，荧光显微镜观察到心肌内可见红色荧光，说明心肌内吞了Exosomes。（2）Exosomes移植治疗心肌梗死后，超声心动图检查结果显示， LV-circ-exo组LVEF值和LVFS值均明显高于Control组（P<0.01），LV-circ-exo组LVDd值和LVSd值均明显低于Control组（P<0.01），LV-SiR-circ-exo 组中 LVEF 值和 LVFS 值均明显低于 Control 组（P<0.01），LV-SiR-circ-exo 组中 LVDd 值和 LVSd 值均明显高于 Control 组（P<0.01）；与LV-circ-exo组相比，LV-SiR-circ-exo组中LVEF值和LVFS值均显著减小（P<0.01），LVDd值和LVSd值均显著增大（P<0.01）。TTC染色结果显示，非梗死区域心肌组织染成砖红色，梗死区不着色；与 Control 组相比， LV-circ-exo组心肌梗死面积明显减小（P＜0.05），LV-SiR-circ-exo组心肌梗死面积明显增大（P＜0.05），LV-circ-exo 组心肌梗死面积比 LV-SiR-circ-exo 组明显减小（P<0.05）。HE染色结果显示，与Control组相比，LV-circ-exo组心肌纤维化面积显著减小（P＜0.05），LV-SiR-circ-exo组心肌纤维化面积显著增大（P＜0.05），LV-circ-exo组心肌纤维化面积比LV-SiR-circ-exo组显著减小（P＜0.05）。Masson染色结果显示, Sham组正常心肌组织染成红色，MI组心肌梗死区域染成蓝色；与 Control 组相比，LV-circ-exo 组心肌梗死面积明显减小（P＜0.01）， LV-SiR-circ-exo组心肌梗死面积明显增大（P＜0.01），LV-circ-exo组心肌梗死面积比 LV-SiR-circ-exo 组明显减小（P＜0.01）。免疫组织化学检测结果显示，新生微血管内皮细胞常被染成棕黄色，细胞核染成蓝色；与 Control 组相比， LV-circ-exo 组心肌梗死周边区新生微血管密度明显增加（ P <0.05 ）， LV-SiR-circ-exo 组心肌梗死周边区新生微血管密度明显减少（P <0.05），与LV-circ-exo组相比，LV-Si

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