拟南芥AtNHX5和AtNHX6调节种子贮藏蛋白运输的研究

摘要

Na+,K+/H+反向转运体（NHX）是H+偶联的反向转运蛋白，其生化活性是催化Na+,K+/H+跨膜反向转运。植物NHX在维持细胞离子平衡、调节pH、膜融合、渗透调节、逆境响应、蛋白运输及植物生长发育等过程中起着重要的作用。拟南芥NHX家族包括8个成员，根据亚细胞定位可以分为三类：质膜NHX（AtNHX7/SOS1和AtNHX8），液胞NHX（AtNHX1-AtNHX4）和内膜NHX（endosomal NHX）（AtNHX5和AtNHX6）。目前对于质膜NHX和液胞NHX的研究较为深入，关于内膜NHX的研究才逐渐展开。AtNHX5和AtNHX6是定位于内膜体的NHX，二者氨基酸序列高度相似。AtNHX5和AtNHX6分布于Golgi、TGN和 PVC。研究发现，AtNHX5和AtNHX6能够调节钾/钠离子转运，维持细胞pH平衡，调控蛋白运输。然而关于AtNHX5和AtNHX6调节蛋白运输的分子机理尚不清楚。
　　我们利用分子遗传学、细胞生物学和分子生物学技术方法，观察了拟南芥nhx5 nhx6双突变体植株和种子的生长发育表型，分析了种子贮藏蛋白向蛋白质贮藏液胞（protein storage vacuoles，PSVs）的运输过程。我们进一步观察了nhx5 nhx6 syp22三突变体的生长表型，分析了SNARE复合体的亚细胞定位以及AtNHX5和AtNHX6与SNARE复合体的相互作用。我们的研究目的是阐明AtNHX5和AtNHX6调节蛋白运输的分子机理。
　　本研究取得以下成果：
　　(1)我们首先制备 nhx5 nhx6双突变体并观察其生长发育表型。我们发现 nhx5 nhx6不仅植株矮小、发育受阻，而且角果小、种子产量低，表明 AtNHX5和AtNHX6不仅调节着植株的生长发育也调节着种子的生长和发育。
　　(2)观察人工贮藏蛋白 GFP-CT24向 PSV的运输，发现 GFP-CT24在 nhx5 nhx6中存在于细胞间隙，不能被运输到 PSV中。SDS-PAGE和免疫印迹分析发现，nhx5 nhx6存在种子贮藏蛋白12S球蛋白和2S白蛋白的前体蛋白。免疫透射电镜显示，nhx5 nhx6成熟种子的细胞间隙聚集12S球蛋白前体蛋白。同时发现，在 nhx5 nhx6中，液胞特异性标记蛋白 Spo:GFP不能被运输到液胞中。表明 AtNHX5和 AtNHX6调节着蛋白质向液胞的运输过程。利用激光共聚焦显微镜观察拟南芥成熟种子的PSV形态及大小，发现nhx5 nhx6 PSV数目增多但体积减小，表明 AtNHX5和 AtNHX6调控拟南芥种子 PSV的形成。
　　(3) AtNHX5和 AtNHX6的跨膜区存在四个保守的氨基酸残基，分别为AtNHX5的D164，E188，D193，E320和 AtNHX6的D165，E189，D194。E320。将以上氨基酸残基位点突变后，转化 nhx5 nhx6，经 SDS-PAGE及免疫印迹分析发现，AtNHX5的D164，E188，D193及 AtNHX6的D165。E189，D194氨基酸残基位点影响种子贮藏蛋白的运输，表明 AtNHX5和AtNHX6通过其离子转运活性调节着种子贮藏蛋白的运输过程。
　　(4)通过杂交获得 nhx5 nhx6 syp22三突变体，发现 nhx5 nhx6 syp22表现出比亲本植株更为严重的生长缺陷表型，不仅植株矮化，莲座叶小，抽薹开花延迟，并且角果短小，种子产量低，种子增大，种子败育。表明 AtNHX5、AtNHX6和 AtSYP22对植株和角果的生长发育起着共同的调节作用。利用激光共聚焦显微镜观察 nhx5 nhx6 syp22 PSV形态及大小，发现 nhx5 nhx6 syp22种子细胞 PSV体积变小但数目增多，表明 AtNHX5，AtNHX6和AtSYP22可能共同调控着拟南芥种子细胞 PSV的形成。SDS-PAGE及免疫印迹分析发现，nhx5 nhx6 syp22存在大量的种子贮藏蛋白12S球蛋白和2S白蛋白的前体蛋白，表明 nhx5 nhx6 syp22种子贮藏蛋白运输路径受阻。
　　(5)拟南芥原生质体瞬时表达实验发现，在 nhx5 nhx6中。SNARE蛋白AtVAMP727和 AtSYP22在 PVC的亚细胞定位受到抑制；AtVAMP727和 AtSYP22被滞留在 Golgi和 TGN中，表明 AtNHX5和 AtNHX6调节着 SNARE复合体的亚细胞定位。拟南芥原生质体瞬时表达实验发现。AtNHX5或 AtNHX6和 AtSYP22和 AtVAMP727共定位于 PVC之中；但是免疫共沉淀（Co-IP）并未检测出 AtNHX5或 AtNHX6与 SNARE蛋白 SYP22、VTI11或 SYP51有相互作用，表明 AtNHX5或 AtNHX6与SNARE复合体无直接的相互作用。
　　总之，我们的研究表明，AtNHX5和 AtNHX6调节种子贮藏蛋白的运输。AtNHX5和 AtNHX6通过调节 SNARE复合体的亚细胞定位而调控着种子贮藏蛋白向 PSV的运输。AtNHX5和 AtNHX6通过其离子转运活性调节着蛋白质的运输过程。