miR-152-3p调控人诱导多能干细胞定向分化为胰岛素分泌细胞的作用

摘要

目的：本课题组前期在筛选与胰腺发育相关的miRNA时发现miR-152-3p参与胰岛β细胞分化、凋亡过程，但其潜在的作用及机制尚不明确，因此本研究主要探讨 miR-152-3p 在人诱导多能性干细胞(human induced pluripotent stem cells, hiPSCs)向IPCs分化过程中的作用，是否可促进hiPSCs向胰岛素分泌细胞分化的效率和成熟度，为干细胞治疗糖尿病奠定实验基础。 方法：采用四步法诱导方案诱导hiPSCs向IPCs分化，倒置显微镜观察细胞分化过程中的形态变化；S-poly(T) plus Real-Time PCR检测各分化阶段miR-152-3p的表达水平；利用miR-152-3p过表达或抑制表达慢病毒载体分别感染hiPSCs，构建miR-152-3p过表达或抑制表达hiPSCs细胞系；分别诱导miR-152-3p过表达或抑制表达hiPSCs分化为IPCs，分阶段收集限定性内胚层细胞、胰腺祖细胞、胰岛素分泌细胞，Real-Time PCR检测各阶段标志性基因Sox17、Foxa2、PDX1、NKX6.1、Insulin、MAFA的表达水平；免疫荧光检测各阶段关键转录因子Sox17、Foxa2、PDX1、NKX6.1、Insulin的表达水平和定位，流式细胞术检测各阶段分化效率，葡萄糖刺激实验检测胰岛素分泌细胞对葡萄糖的应答能力。 结果：miR-152-3p在hiPSCs向IPCs分化过程中表达呈持续上调，在限定性内胚层阶段、前肠管细胞阶段、胰腺祖细胞阶段、胰岛素分泌细胞阶段miR-152-3p表达分别增加约2倍、10倍、70倍、200倍；在成功构建的过表达或抑制表达的2个hiPSCs系中，miR-152-3p过表达hiPSCs细胞系中miR-152-3p表达上调约18倍，miR-152-3p抑制表达hiPSCs细胞系中miR-152-3p下游靶基因DNMT1的表达水平上调约4倍；miR-152-3p抑制表达细胞系中Sox17、Foxa2、PDX1、NKX6.1、Insulin、MAFA基因表达水平显著上调，miR-152-3p过表达细胞系则显著下调；miR-152-3p抑制表达细胞系中Sox17+Foxa2+、PDX1+NKX6.1+双阳性细胞和insulin+细胞比例明显高于对照组和miR-152-3p过表达组(P<0.05) ，而miR-152-3p过表达细胞系中Sox17+Foxa2+、PDX1+NKX6.1+双阳性细胞和insulin+细胞数量较对照组少(P<0.05)；对照组IPCs分化效率为20.8%，miR-152-3p抑制表达组IPCs的分化效率为28.5%，miR-152-3p过表达组IPCs分化效率为11.2%，抑制表达组分化效率明显高于对照组和过表达组(P<0.05)，而过表达组分化效较对照组低(P<0.05)；葡萄糖刺激实验结果表明，抑制miR-152-3p表达组与对照组和过表达miR-152-3p组比较，胰岛素分泌量和C-肽分泌量显著升高(P<0.01)，而过表达miR-152-3p组较对照组胰岛素和C-肽分泌均有所下降(P<0.05)。 结论：本研究构建了miR-152-3p过表达或抑制表达的hiPSCs细胞系，诱导分化过程中证明抑制miR-152-3p可促进各分化阶段标志性基因和关键转录因子的表达，促使hiPSCs向IPCs分化，提高IPCs的分化效率和胰岛素的分泌能力；而过表达miR-152-3p可抑制hiPSCs向IPCs分化和胰岛素分泌。表明miR-152-3p在hiPSCs体外分化为IPCs的过程中发挥负调控作用。

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