一种半胱氨酸改造的MLIF类似物对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用的研究；兰州地区健康成人脉冲振荡肺功能正常值的分析研究

摘要

本文对一种半胱氨酸改造的MLIF类似物对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及兰州地区健康成人脉冲振荡肺功能正常值的分析进行了研究。本研究分为两个部分：
　　第一部分：缺血性脑血管病（ischemic cerebrovascular disease。ICVD）是目前在临床上常见的一种神经系统疾病。ICVD发生时，缺血再灌注引起的继发性损伤的关键环节是急性炎症反应。此时细胞因子被大量的释放、粘附分子的表达明显升高，白细胞及其它免疫细胞被激活，从而释放各种炎性介质如细胞因子包括TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、趋化因子及粘附分子等，TNF-α被认为是炎症网络中的关键因子，是全身炎症反应的始动介质，同时，缺血再灌注时脂质过氧化反应明显加速，自由基的平衡被打破，其产生过量而清除减少，这些因素都严重损伤了神经细胞。因此，减轻炎症反应、减少自由基就对保护缺血再灌注后的神经功能具有重要意义。单核细胞移动抑制因子（monocyte locomotion inhibitory factor，MLIF）是一种抗炎性反应的多肽，它能抑制人单核细胞、多形核白细胞的移动，抑制炎症反应的发生、逃避宿主免疫，同时它还对细胞因子TNF-α、IL-1β等的分泌以及相应受体的表达有明显的抑制作用，从而影响炎症反应的整个过程。研究表明MLIF的抗炎活性基团是Cys-Asn-Ser。本实验试图通过对MLIF的活性基团Cys-Asn-Ser的N端进行修饰，了解新的修饰后的MLIF类似物对大鼠脑缺血再灌注后神经功能改变及TNF-α、IL-1β表达的影响，来研究这种新的MLIF类似物可能的药理作用机制，从而为临床水平的研究提供理论依据，以便将来更好地造福缺血性脑病的患者。
　　目的：对抗炎肽MLIF的活性肽段Cys-Asn-Ser的N端进行了全新设计和化学结构改造。为了提高Cys-Asn-Ser的抗氧化活性，我们在Cys-Asn-Ser的N端连接一个极性不带电荷的半胱氨酸。采用固相合成法合成一条全新设计的MLIF类似物Cys-Cys-Asn-Ser以及MLIF活性基团小分子肽段 Cys-Asn-Ser；建立大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型，以 MLIF活性基团小分子肽段Cys-Asn-Ser作为对照，考察这个新的MLIF类似物对大鼠缺血性脑病是否具有治疗作用，并初步探讨这种作用可能的发生机制。
　　方法：⑴采用固相合成法，合成一个新的半胱氨酸改造的MLIF类似物Cys-Cys-Asn-Ser和MLIF的活性基团小分子肽段Cys-Asn-Ser，然后对合成的粗肽进行脱盐处理选用的是Sephadex G10凝胶柱，并结合制备型HPLC纯化粗肽，最后采用MS对纯化产物进行鉴定。⑵用线栓来阻塞大脑中动脉，从而构建SD大鼠脑缺血再灌注损伤的模型，待造模成功、缺血再灌注24h的时候，采用Longa法对大鼠神经功能缺损进行评分；大鼠脑切片进行 TTC染色，观察脑缺血再灌注后脑梗死体积的变化，探讨这个新的半胱氨酸改造的MLIF类似物Cys-Cys-Asn-Ser对缺血性脑病的治疗作用。⑶在大鼠脑缺血再灌注24h后，取大鼠脑组织匀浆测定TNF-α和IL-1β的含量，观察这个新改造的MLIF类似物Cys-Cys-Asn-Ser的抗炎活性。
　　结果：①采用固相合成法获取的新的由半胱氨酸改造的MLIF类似物Cys-Cys-Asn-Ser和MLIF的活性基团小分子肽段Cys-Asn-Ser，前者的产率是40.5％，后者的产率是61.2%，HPLC分离纯化后，证明二者的纯度均达到95%以上，且经质谱对产物的鉴定，结构完全相符。②实验的结果表明，模型组大鼠均出现了严重的神经功能受损的症状，神经功能评分的结果为(2.20±0.45)；大鼠缺血侧的脑组织有非常明显的梗死灶，测得梗死体积为(152.85±28.83)mm3；而与模型组大鼠不同的是，各药物治疗组均在不同程度上改善了MCAO大鼠的病理改变，包括减小脑梗死的体积和降低神经功能评分。与活性基团小分子肽段Cys-Asn-Ser相比，新的MLIF类似物Cys-Cys-Asn-Ser的活性有所提高。③从TNF-α和IL-1β的检测数据来看，用一个半胱氨酸对MLIF活性基团小分子肽段Cys-Asn-Ser修饰后，新的MLIF类似物Cys-Cys-Asn-Ser的抗炎活性有所增强。由此可见，新的MLIF类似物Cys-Cys-Asn-Ser有抑制炎症反应的作用，同时它自身又有着抗氧化的作用，这两方面的原因使得它对于缺血性脑损伤有保护作用。
　　结论：一种新的MLIF类似物Cys-Cys-Asn-Ser对缺血性再灌注脑损伤有一定的神经保护作用，同时其修饰后的抗炎活性比MLIF活性基团小分子肽段Cys-Asn-Ser有所增强。
　　第二部分：呼吸系统疾病是严重危害人民健康的常见病、多发病，已经构成影响公共健康的重大问题。其不仅发病率高，许多疾病起病隐袭，肺功能损害严重，致残率高，给社会和国民经济造成了巨大损失。因此，呼吸系统疾病的早诊断、早治疗、早预防就显得尤为重要。在呼吸系统疾病的检查方法中，呼吸功能的测定已经越来越受到人们的重视，但肺功能检查常规项目的信号源均是受试者自己的呼吸，检查结果可靠与否与受试者自己的理解能力和配合能力密切相关，对于一些特殊人群如年老、体弱、幼儿等患者，就不能进行这样的检查，而脉冲振荡法（impulse oscillometry，IOS）测定技术的突出优点是受试者仅需平静呼吸，操作简便、适用对象广泛，目前在临床上越来越受到青睐。影响肺功能检查的正常值的因素非常多，主要与受试者的种族、年龄、性别、体重、身高等因素密切相关，其次还与受试者的生存环境、工种、体力活动及吸烟与否等因素也有关。因此，临床上选取合适的预计值，才是提高诊断准确率的关键。中国目前仍然没有统一的脉冲振荡法（IOS）测定的各参数的参考预计值及正常值公式，现在临床沿用的还是欧美国家（主要是欧洲）提供的正常值范围，这些预计值不一定符合中国人的实际，而且国内各地区在应用IOS法做肺功能测定时的标准亦不一致，这样就不利于对疾病做出准确诊断。
　　目的：建立我国自己的IOS肺功能预计值公式，制定出兰州地区IOS正常值及预计值公式。为兰州地区乃至西北五省的临床医生尤其是呼吸科医生提供参考，也将为国内其他地区的临床医生提供一个线索，为争取早日建立我国自己的、统一的预计值公式及正常值标准奠定基础。
　　方法：研究对象共计920例，其中女470例，男450例。选择对象是：2008年2月至2011年12月在兰州大学第二医院进行体检的18岁及以上的健康成人；外科非心肺和非气道疾病择期手术的术前检查者。研究方法欧洲呼吸学会（ERS）推荐的IOS测量标准是本研究所采用的检查方法。检查前至少24 h内未用过胆碱能受体拮抗剂、抗过敏类药物、茶碱类药物、β2受体激动剂、肾上腺素能受体抑制剂及激素类药物等。测定的指标包括：IOS参数、结构参数图、频谱分析图、阻抗容积图（Z-V图）等。其中实验测定的IOS的主要参数为：呼吸总阻抗（Zrs）、中心气道阻力（R20）、总气道阻力（R5）、中心阻力（Rc）、周边阻力（Rp）、周边粘性阻力（R5-R20）、共振频率（Fres）及周边弹性阻力（X5）。统计学分析使用SPSS17.0软件进行数据分析。
　　结果：⑴对兰州地区920例18岁及以上健康成人严格按照欧洲呼吸学会（RES）推荐的IOS测量标准进行IOS测定，IOS参数Zrs、Fres、R5、R20、X5、Rc、Rp均不呈正态分布。⑵各参数正常参考值范围与目前临床上一直在采用的国外提供的正常参考值范围，二者的配对t检验（P＜0.001）有显著性差异。⑶在兰州地区，分别建立了当地成人健康男性和健康女性 IOS主要参数（Zrs、Fres、R5、R20、X5、）的正常参考值预计公式。⑷共振频率（Fres）均值及95%可信区间均大于目前国内外采用的10Hz正常值，甚至大于15Hz，男女相比无显著性差异。⑸根据建立的兰州地区健康成人的IOS各参数的正常参考值预计公式，表明粘性阻力（R）主要与体重、身高相关，与体重呈正相关，而身高的影响最大，呈负相关。⑹在本研究所涉及的年龄范围内（18岁～80岁），IOS各参数值（除外X5）随着年龄的增长无明显变化，而X5与年龄成负相关。
　　结论：兰州地区健康成人脉冲振荡（IOS）肺功能各参数的正常参考值范围及预计值公式与国内、外均有差异，建议中国构建适合国人自己的IOS各参数的正常参考值范围及预计值公式。

目录

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声明

第一部分 一种半胱氨酸改造的MLIF类似物对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用研究

中文摘要

Abstract

目录

第一章 文献综述

第二章 选题依据

第三章 研究内容

第四章 实验部分

第五章 结 论

参考文献

英文缩写及符号说明表

第二部分兰州地区健康成人脉冲振荡肺功能正常值的分析研究

中文摘要

Abstract

目录

一、前 言

二、材料和方法

三、结 果

四、讨论

五、结 论

六、参考文献

英文缩写及符号说明表

个人简历

在学期间的研究成果

致谢