结节乳状体核在丙泊酚麻醉意识消失和恢复中的作用研究

摘要

目的：丙泊酚是广泛应用于临床的静脉麻醉药，是一种GABAA型受体激动剂，但导致意识消失的确切机制仍未阐明。研究与我们的前期工作发现，丙泊酚麻醉致意识消失和恢复与睡眠-觉醒的过程有一定相似性。结节乳状体核（Tuberomammillary Nucleus,TMN）是睡眠-觉醒环路中的主要组成部分，也是大脑中组胺的唯一来源。组胺的分泌受GABA调控，同时反馈抑制GABA的释放。故本课题旨在研究TMN组胺神经元在丙泊酚麻醉致意识消失和恢复中的作用。 方法：1、筛选腹腔注射丙泊酚的最佳剂量：随机选取42只野生型C57小鼠，采用50、60、70、80、90、100（mg/kg）的剂量进行丙泊酚腹腔注射，筛选出小鼠腹腔注射产生翻正反射消失（Loss of right reflex, LORR）的最佳剂量；2、建立损毁模型进行行为学和脑电图检测：将42只野生型C57小鼠随机分为药物损毁组（Saporin）、生理盐水组（NS）和空白对照组（Control），n=14，采用脑区微注射的方法在前两组小鼠两侧TMN分别注射药物（Orexin2R-Saporin，250 ng/μl）或生理盐水，每侧0.2μl，并埋入脑电图记录电极，独笼饲养2周后，检测丙泊酚麻醉翻正反射消失和翻正反射恢复（Recovery of right reflex, RORR）时间以及脑电图表现；3、光纤钙信号记录：随机选取6只小鼠，在一侧TMN微注射带有钙离子浓度敏感蛋白的病毒（rAAV-hSyn-Gcamp6s-WPRE-pA）0.3μl,并在注射位点上方200μm处植入光纤，待病毒成功表达后，用488 nm的激光光源激活TMN神经元上的钙敏感蛋白，采用光纤钙信号记录系统实时检测丙泊酚麻醉下TMN神经元荧光信号的变化，来判断丙泊酚对神经元活动的影响；4、免疫荧光染色：将上述小鼠进行灌注、取脑，固定脱水后，用组胺神经元特异性抗体（抗组氨酸脱羧酶抗体）做免疫荧光染色，进行组织学验证。 结果：1、小鼠丙泊酚腹腔注射100%发生LORR的剂量为90 mg/kg,做剂量-反应曲线后，得到ED50为69.21 mg/kg；2、采用药物（Orexin2R-Saporin）选择性损毁TMN后（损毁率：69.57%），药物损毁组、生理盐水组、空白对照组三组小鼠在发生LORR和RORR的时间以及脑电图表现上无统计学差异（P＞0.05）；3、光纤钙信号实时记录发现，丙泊酚麻醉下发生LORR时荧光信号明显降低（P＜0.05），发生RORR时荧光信号上升（P＜0.05），但未较快恢复到麻醉前水平。 结论：1、丙泊酚麻醉导致意识消失时能明显抑制小鼠TMN组胺能神经元的激活；2、选择性药物损毁TMN神经元后，丙泊酚麻醉小鼠的行为学和脑电图表现无统计学差异，提示TMN组胺神经元不是丙泊酚发挥麻醉效应的主要部位。

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Abstract

1.2 主要实验试剂

1.3 主要实验仪器

1.4.1 筛选丙泊酚腹腔注射的最佳剂量

1.4.2 TMN脑区微注射模型的建立

1.4.3 行为学和脑电图记录

1.4.4 光纤钙信号记录

1.4.5 免疫荧光染色

1.5 统计方法

2.2.1 三组间的LORR及RORR时间无统计学差异

2.2.2 损毁组免疫荧光染色验证损毁率为69.57%

2.4.1 丙泊酚抑制了小鼠TMN组胺神经元的钙活动

2.4.2 免疫荧光染色验证GCamp6病毒成功转染TMN组胺神经元

3.1 丙泊酚抑制TMN神经元活动

3.2 损毁TMN神经元未见丙泊酚麻醉的行为学和脑电图变化

3.3 本实验的不足和可深化之处

1 大脑中的组胺系统

1.1 发育

1.2 解剖位置

1.3 人类大脑

1.4 细胞形态

1.5 电生理特性

1.6 共传递递质

1.7 组胺的合成与代谢

1.8 神经输入

1.9 组胺能通路和靶体

1.10 组胺能的代谢受体

⑵、H2受体

⑶、H3受体

2 组胺系统在睡眠觉醒中的作用

2.1 内源性组胺在睡眠-觉醒中的作用

2.2 组胺的代谢受体在睡眠-觉醒中的作用

2.3 组胺通路和其他通路的相互作用